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標題: 甘露聚糖酶檢測方法！ [打印本頁]
作者: gentech    時間: 2007-9-29 22:29
標題: 甘露聚糖酶檢測方法！
甘露聚糖酶活性的檢驗方法
原理 甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖. 應用二硝基水楊酸分光光度計法測定還原 糖的釋放量. 活性單位 1甘露聚糖酶單位(MNU) 是指在標準條件下, 1秒鐘內(nèi)從一定濃度甘露聚糖溶液中釋放具有還原能力相當于1納摩爾甘露糖所需酶的量。 適用范圍 本方法適合于含有產(chǎn)自木霉的甘露聚糖酶的酶制劑樣品的測定. 安全 DNS試劑對人體有害, 防止吸入, 與皮膚及眼接觸. 試驗條件 底物: 半乳甘露聚糖 PH : 5.3 溫度: 50°C ± 0.5°C 時間: 5 分鐘 儀器 水浴鍋 50°C 水浴鍋 100°C 試管混勻器 分光光度計 試劑 所有溶液均用非離子水配制. 1. 檸檬酸緩沖液(0.05M, PH 5.3) 將10.5克檸檬酸(C6H8O7×H2O, Merk244) 溶入約800毫升水中, 用 1M NaOH調(diào)整PH為5.3 (消耗量約為110ml). 在容量瓶中定容1000毫升. 2. 底物- 0.3%半乳甘露聚糖 將0.6g 槐兒豆膠(Sigma G-0753)溶解于 60°C檸檬酸緩沖液中,用廚 房混合機混勻.在磁振動加熱器上加熱至沸點. 在冷房內(nèi)(2-8°C)攪 動冷卻至室溫, 并使其過液溶解. 離心(10000轉(zhuǎn)/分鐘, 10分鐘) 除去不 溶性沉淀物, 加入檸檬酸緩沖液定容至200毫升. 在 -20°C冷凍儲存, 用沸水水浴鍋解凍并升溫至80°C. 3. DNS 試劑 將50.0克 3,5-二硝基水楊酸溶入約4升水中. 在連續(xù)磁振動條件下, 逐漸加入80.0克 NaOH 并使其溶解. 加入1500克酒石酸鉀鈉(Merck, 8087). 溶液可能升溫至最大45°C. 冷卻至室溫并加水定容至5000毫升. 如果溶液混濁, 用Whatman 1號濾紙過濾. 在室溫下儲存于深色瓶中. 樣品 樣品用檸檬酸緩沖液稀釋. 合適的稀釋度為在反應后的吸光度為0.10-0.40. 試驗 在兩只試管中各加入1.8毫升底物溶液并在50°C平衡5分鐘. 向一支試管加入200微升樣品稀釋液并混勻. 在準確5分鐘后, 向每只試管加入3.0 毫升DNS試劑并混勻.在不含樣品的試管(對照)加入200微升樣品溶液. 將兩只試管從水浴中取出立即放入開水浴中. 準確5分鐘取出用冷水冷卻至室溫. 在540nm測定樣品(相對于對照)的吸光度. 從標準曲線讀出活性并乘以稀釋倍數(shù). 標準 制備20 mM 甘露糖儲存液. 溶解360毫克甘露糖(Sigma M-6020) 于帶刻度的燒瓶中, 用檸檬酸緩沖液溶解并定容至100毫升. 儲存液可 在-20°C儲存, 解凍后混勻. 儲存液用檸檬酸緩沖液稀釋配制成以下稀釋液.
稀釋液 緩沖液 (ml) 甘露糖 mmol/ml 甘露聚糖酶活性 MNU/ml
1:1.5 1:3 1:5 1:7 8.5 7 5 3 3 6 10 14 10 20 33.3 46.7
將每種標準稀釋液用同樣方法做重復試驗: 吸取1.8毫升底物, 在50°C培養(yǎng)5分鐘, 加入3毫升DNS和200微升標準稀釋液. 對照的制備: 加入200微升緩沖液, 不加標準稀釋液. 煮沸試管準確5分鐘, 冷卻至室溫. 在540nm 測定相對于對照的吸光度. 繪制吸光度相對于甘露聚糖酶活性(MNU/ml)的曲線. 根據(jù)每次測試, 繪制一個新的標準線. 乘以甘露糖的稀釋倍數(shù)1000再除以反應時間(300秒), 即得出甘露聚糖酶活性(MNU/ml).
作者: sherier    時間: 2007-9-30 08:38
是行標了嗎？？:hehe:



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