畜牧人

標(biāo)題: 瘦肉精的檢測(cè)方法 [打印本頁(yè)]
作者: 蒙城獸醫(yī)    時(shí)間: 2008-7-30 15:34
標(biāo)題: 瘦肉精的檢測(cè)方法
我一直在找瘦肉精的檢測(cè)方法
知道的請(qǐng)回復(fù)。
謝謝！
作者: 激光打印機(jī)    時(shí)間: 2008-7-30 22:18
這個(gè)..
還真不知道
這個(gè)東西只要飼料廠自己不去加的話，沒必要自己檢測(cè)吧?
作者: 白冰    時(shí)間: 2008-8-1 16:11
1  測(cè)定原理

“瘦肉精”克侖特羅競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫檢測(cè)方法快速測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)板的微孔包被有針對(duì)兔抗克侖特羅特異性抗體的羊抗體（第二抗體）。加入兔抗克侖特羅特異性抗體（第一抗體）與第二抗體結(jié)合而被固定，洗滌后加入標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液與酶結(jié)合物（酶標(biāo)記抗原），標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中的游離抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)兔抗克侖特羅特異性抗體上有限的結(jié)合位點(diǎn)。通過洗滌除去沒有與特異性抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原，加入酶基質(zhì)（過氧化脲）和發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）并孵育，結(jié)合到板上的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的底物。加酸終止反應(yīng)后，顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在單波長(zhǎng)450 nm處測(cè)吸光度，吸收光強(qiáng)度與樣品中的克侖特羅濃度成反比。

2  試劑盒的組成

每個(gè)盒中（包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔）材料如下：

（1）1×96孔板（12排×8孔），包被有第二抗體（兔IgG抗體）；（2）6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（300ul/瓶）為克侖特羅水溶液。濃度分別為0 ng/kg、100 ng/kg、300 ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg；（3）1個(gè)克侖特羅過氧物酶標(biāo)記物濃縮液12 ml（紅色帽）；（4）1個(gè)克侖特羅抗體濃縮液12 ml（黑色帽）；（5）1個(gè)酶基質(zhì)/發(fā)色劑11 ml（藍(lán)色帽）；（6）1個(gè)反應(yīng)停止液，1 mol/L硫酸14 ml（黃色帽）；（7）1個(gè)緩沖液25 ml，酶標(biāo)記物及抗體濃縮液稀釋用。

3  試驗(yàn)材料

3.1  設(shè)備

微孔板酶標(biāo)儀（450 nm）、均質(zhì)器、冷凍離心機(jī)、離心管（50 ml）、微量可調(diào)移液器（單道、八道）、RIDAC18柱、濾紙（0.45μm）。

3.2試劑

甲醇（分析純、100%）、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0）、500 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0）、1 mol/LNaOH。

4  儲(chǔ)存條件

試劑盒保存于2-8℃，不要冷凍。不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與干燥劑一起重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，避免直接暴露在光線下。

5  試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色劑有任何顏色表明已變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光值小于0.6時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

6  樣品處理

6.1　尿樣

尿樣一般不用處理，取20清亮尿樣直接測(cè)定。如果尿樣混濁要過濾或離心至得到清亮尿樣。

6.2　肝臟、肉樣

粉碎的5 g樣品與25 ml 50 mmol/L HCL混合，振蕩1.5 h，以達(dá)到均質(zhì)的目的。稱6 g均質(zhì)物（相當(dāng)于1 g肝臟），加入離心管中。10-15℃條件下（非常重要）4000轉(zhuǎn)/min或更高的轉(zhuǎn)速離心15 min。轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)離心管中，加300μl 1mol/L NaOH混合15 min。加入4 ml 500 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0），簡(jiǎn)單混合并在4℃保存至少1.5 h或過夜（非常重要）。10-15℃條件下（非常重要）4000轉(zhuǎn)/min或更高的轉(zhuǎn)速離心15 min。分離全部上清液（應(yīng)是清亮的，非常重要），使其升至室溫（20-24℃），然后用RIDAC18柱純化。

RIDAC18柱純化樣品必須在室溫條件下（20-24℃），并嚴(yán)格控制過柱時(shí)流速。用3 ml甲醇洗滌柱子，控制流速為1滴/s。用2ml洗滌液（50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH 3.0），洗滌柱子。肝臟、肉樣的全部上清液進(jìn)柱，控制流速為1滴/4s。用2 ml洗滌液（50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH 3.0），洗滌柱子，流速為1滴/s。用正壓除去殘留的流體并用空氣或氮?dú)獯? min，干燥柱子。用1 ml甲醇洗脫樣品，控制流速1滴/4s。在50-60℃并在弱空氣或氮?dú)饬飨峦耆舭l(fā)甲醇溶劑。用1 ml蒸餾水溶解干燥的殘留物，取20μl進(jìn)行分析。

6.3飼料

取10ｇ飼料樣品，用10 mmol/LHCL溶解，連續(xù)震蕩10 min，用濾紙過濾，在濾液中加入120μl 1mol/L NaOH進(jìn)行中和，檢查pH，用NaOH控制PH值在6.5-7.5之間，取上清液20μl進(jìn)行分析。稀釋倍數(shù)為25（即含有0.04 g飼料樣品/ml）。

7  測(cè)定步驟

第一步：所有試劑及樣品在開始檢測(cè)前必須回升至室溫（20-24℃），測(cè)定操作在20-24℃下進(jìn)行。

第二步：用盒中緩沖液以體積1﹕10的比例稀釋實(shí)際用量的克侖特羅抗體濃縮液（黑色蓋），稀釋前輕輕混均抗體，不要猛烈振蕩。

第三步：取出實(shí)驗(yàn)需要數(shù)量的微孔板條，足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用的數(shù)量，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行試驗(yàn)，記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。剩余的微孔板條放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，置于2-8℃冷藏。

第四步：每個(gè)微孔中底部加100μl稀釋后的抗體溶液，室溫（20-24℃）孵育微孔板15 min，避免光線照射。

第五步：孵育的同時(shí)進(jìn)行酶標(biāo)記物的稀釋，用盒中緩沖液以體積1﹕10的比例稀釋實(shí)際用量的克侖特羅酶標(biāo)記物濃縮液（紅色蓋），稀釋前輕輕混均抗體，不要猛烈振蕩，避光放置。

第六步：洗板，甩出孔中液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打，直到紙上無明顯水跡（拍打3次），以保證完全除去孔中的液體。用250μl蒸餾水充入孔中，再次甩掉微孔中液體，并在吸水紙上拍打，重復(fù)操作兩次。加洗滌水的移液器管尖必須置于微孔上方約0.5 cm處打出洗滌水，避免將板孔中的游離抗體帶入洗滌水中。洗板后立即進(jìn)行下一步操作，不要讓板孔干燥。

第七步：加入20μl標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔底部，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

第八步：加入100μl稀釋了的酶標(biāo)記物至微孔底部，輕輕震蕩微孔析并在桌面上作圓周運(yùn)動(dòng)以混勻。移液器管尖不要接觸到孔中的混合物，避免交叉污染。

第九步：室溫孵育微孔板30 min，避免放置，盡可能每隔10 min輕輕振蕩1次，準(zhǔn)備好酶基質(zhì)/發(fā)色劑，并注意避光放置。

第十步：洗板，同第六步。在洗板過程中加洗滌水的移液器置于微孔板上方0.5 cm處打出洗滌水，避免將板孔中的游離酶標(biāo)記物帶入洗滌水中。

第十一步：不要讓板孔干燥，迅速加入100μl酶基質(zhì)/發(fā)色劑到每個(gè)孔中，步驟操作要迅速，避免頭尾反應(yīng)時(shí)間相差過長(zhǎng)，輕輕振蕩板并在桌面上作圓周運(yùn)動(dòng)以混勻。移液器管尖不要接觸微孔中的混合物，避免交叉污染。

第十二步：室溫暗處孵育微孔板15 min，暗處避光放置，同時(shí)準(zhǔn)備好反應(yīng)停止液。

第十三步：每孔加入100μl反應(yīng)停止液，混勻，60 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處波長(zhǎng)吸光度值。

8  結(jié)果

所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值再乘以100，并且以百分比的形式給出吸光度值。

吸光度值（％）＝ ×100

計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值（吸光度值）繪成一個(gè)對(duì)應(yīng)克侖特羅濃度（mg/kg）的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在200-2000 ng/kg范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度（ng/kg）可以從校正曲線上讀出
作者: 蒙城獸醫(yī)    時(shí)間: 2008-8-11 14:10
收到！謝謝了，兄弟。
想當(dāng)年我還是禽病板塊的版主呢，06年改行當(dāng)老師，丟了版主，08年咱又殺回來啦。
謝謝兄弟。
作者: quickingbiotech    時(shí)間: 2010-1-30 13:11
本帖最后由 quickingbiotech 于 2010-1-30 13:15 編輯

回復(fù) 1# 蒙城獸醫(yī)     目前，檢測(cè)瘦肉精的方法主要有四種，即高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CE)和免疫分析技術(shù)(IA)。而我國(guó)結(jié)合自己的實(shí)際情況，2001年農(nóng)業(yè)部首先組織制定了飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定標(biāo)淮。該標(biāo)準(zhǔn)選擇確定了兩種：即高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)。其中將HPLC法作為檢測(cè)瘦肉精的半確證性方法，其最低檢測(cè)限為0.05μg/ kg，優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)精確度高，而且假陽(yáng)性率低；缺點(diǎn)是檢測(cè)過程煩瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需貴重儀器、難于操作、價(jià)格昂貴。而GC-MS法優(yōu)點(diǎn)是能在多種殘留物同時(shí)存在的情況下對(duì)某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析。GC-MS法與HPLC法相比，檢測(cè)靈敏度更高，假陽(yáng)性率更低，已將GC-MS法定為檢測(cè)瘦肉精的確證性方法。GC-MS法的缺點(diǎn)同HPLC相似。免疫層析法目前被認(rèn)為是最簡(jiǎn)便快捷的方法，適合于基層和肉制品加工企業(yè)，飼料生產(chǎn)企業(yè)以及養(yǎng)殖廠使用。
作者: quickingbiotech    時(shí)間: 2010-1-30 13:14
本帖最后由 quickingbiotech 于 2010-1-30 13:15 編輯

回復(fù) 3# 白冰       ，試劑盒是定量的，但是用瘦肉精膠體金檢測(cè)試紙更快捷，只需要10~15分鐘就可以出結(jié)果，使用方法簡(jiǎn)單，適合基層及肉制品加工企業(yè)和飼料生產(chǎn)企業(yè)以及養(yǎng)殖廠使用。



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