畜牧人

標(biāo)題: 木聚糖酶酶活力的測(cè)定方法 [打印本頁]
作者: 和興    時(shí)間: 2008-8-6 16:51
標(biāo)題: 木聚糖酶酶活力的測(cè)定方法
1．木聚糖酶的活力單位定義：
在50℃，pH為6.50條件下，每分鐘從濃度為10mg/mL的燕麥木聚糖溶液中釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)活力單位（IU）。
2．測(cè)定原理
在50℃，pH為6.50條件下木聚糖酶水解木聚糖，產(chǎn)生分子量較小的聚合物和還原糖，還原糖可將3，5-二硝基水楊酸中的硝基還原成橙色的氨基化合物。利用比色法測(cè)出還原糖的量，從而計(jì)算出酶活力。
3．試劑和溶液
3.1 10.0mg/mL 的木糖溶液
稱取的無水木糖1.0000g加水溶解后定容至100mL。
3.20.05mol/M 的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉中性緩沖液
a、 0.5mol/L磷酸二氫鈉溶液
準(zhǔn)確稱取39.0g磷酸二氫鈉完全溶解于400mL的蒸餾水中，定容至500mL，標(biāo)記為A溶液；
b、0.5mol/L磷酸氫二鈉溶液
準(zhǔn)確稱取89.5g磷酸氫二鈉完全溶解于400mL的蒸餾水中，定容至500mL，標(biāo)記為B溶液；
c、0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液
取342.5mL的A液與157.5的B液混勻，標(biāo)記為C液。
d、0.05mol/L的中性緩沖液（pH=6.50）
取C液500mL加入到4000mL 的蒸餾水中，必要時(shí)用3mol/L的鹽酸溶液或3mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH為6.50，再定容5000mL，混勻后標(biāo)記為0.05mol/L的中性緩沖液，同時(shí)標(biāo)記pH=6.50、配制日期。在4℃冰箱內(nèi)保存。
3．31.0％木聚糖溶液（底物）
精密稱取燕麥木聚糖1.0000g溶于40mL0.1mol/L的氫氧化鈉溶液中，室溫下磁力攪拌12小時(shí)以上。用3mol/L鹽酸溶液或3mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為6.5，加0.05mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉中性緩沖液至90mL，再調(diào)pH值為6.50，然后用0.05mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉中性緩沖液定容至100mL。標(biāo)記為1.0%木聚糖底物，同時(shí)標(biāo)記pH=6.50、配制日期。保存在4℃的冰箱內(nèi)。
3．4DNS試劑
溶解10.0g 3，5-二硝基水楊酸、16g氫氧化鈉和300g酒石酸鉀鈉于約700mL蒸餾水中，加熱攪拌使完全溶解至澄清，放至常溫并定容至1000mL，置棕色試劑瓶中，暗處保存一個(gè)星期后使用。
4．儀器和設(shè)備
4．1 分析天平：感量0.0001g
4．2 精密pH計(jì)：精確至0.01
4．3 磁力加熱攪拌器
4．4 分光光度計(jì)：應(yīng)符合GB9721有關(guān)規(guī)定，5mm比色皿
4．5 電熱恒溫水浴鍋：30-100℃，±0.1℃
4．6 計(jì)時(shí)器：每小時(shí)誤差不超過五秒
4．7 移液器：100-1000μl
4．8 微樣進(jìn)量器：0-50μl
5．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取8支試管按下表加入試劑，稀釋木糖標(biāo)準(zhǔn)液；再加入3mL DNS試劑。充分混勻置沸水中煮5min，水浴冷卻后，用0號(hào)試管做對(duì)照在540nm下測(cè)其它試液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以木糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
試管號(hào)
0
1
2
3
4
5
6
7
緩沖液加入量（μL）
500
490
480
475
470
465
460
455
1.0%中性木聚糖酶底物（μL）
500
500
500
500
500
500
500
500
木糖標(biāo)準(zhǔn)液（μL）
0
10
20
25
30
35
40
45
木糖含量
0
100
200
250
300
350
400
450
6．待測(cè)酶液的制備
精密稱取固體原酶粉1.0000g溶于80mL蒸餾水中（稀釋倍數(shù)≤100倍直接用緩沖液溶解）；室溫下磁力攪拌15min以上，用100mL容量瓶定容，離心后取上清液用緩沖液稀釋，使其吸光度在0.2-0.25之間。
7．水平控制液的制備
稱取1.000木聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)示酶活力為5000IU/mL），溶于80mL蒸餾水中，室溫下磁力攪拌5min以上，用100mL容量瓶定容，離心后取上清液用0.05mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉中性（pH=6.50）的緩沖液稀釋300倍。新鮮水平控制液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
8．測(cè)定步驟
8．1 取三支試管各加入0.5mL底物，與待測(cè)酶液一起在50℃（±1℃）水浴中預(yù)熱5min。
8．2在第一、二試管中各加入0.5mL的待測(cè)酶液，50℃水浴中反應(yīng)15min。
8．3 在三支試管中各加入3mL 的DNS試劑，然后在第三支試管中加入0.5mL的待測(cè)酶液。
8．4搖勻三支試管后，在沸水浴中煮10min。
8．5水浴冷卻至室溫后，以第三支試管為對(duì)照在540nm條件下測(cè)第一、二支試管的吸光值。吸光值以0.2-0.25之間為宜，若不在此范圍內(nèi)可改變稀釋倍數(shù)重做。
9．結(jié)果計(jì)算
酶活力（IU/g或IU/mL）=（木糖等量值/150/15/0.5）×n
式中：150指木糖從微克換算成微克分子數(shù)
15指待測(cè)液與低物的反應(yīng)時(shí)間
0.5指低物反應(yīng)的待測(cè)酶液量
n指原酶液的稀釋倍數(shù)
10．允許分析結(jié)果可以接受標(biāo)準(zhǔn)：
10．1允許總分析誤差范圍，兩次取樣并且檢測(cè)結(jié)果相對(duì)誤差小于10%。
10．2水平控制檢測(cè)酶活力與標(biāo)準(zhǔn)酶活力誤差小于10%
10．3標(biāo)準(zhǔn)曲線至少由五點(diǎn)組成
作者: 崔若偉    時(shí)間: 2008-12-21 13:21
這種測(cè)定方法的名稱叫什么？
作者: yaya200199    時(shí)間: 2010-7-9 11:50
分光光度計(jì)法測(cè)木聚糖酶活性，這個(gè)方法跟國(guó)標(biāo)的不太一樣啊。
作者: y242168    時(shí)間: 2010-7-9 17:13
呵呵現(xiàn)在沒有燕麥木聚糖了只有樺木木聚糖。還有你的底物溶解時(shí)有問題的，你測(cè)定的結(jié)果會(huì)有誤差。在說飼用類木聚糖酶測(cè)定時(shí)和工業(yè)用木聚糖酶在測(cè)定時(shí)的溫度有差異。要考慮到你的木聚糖酶的作用動(dòng)物體生理活性溫度。



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