畜牧人

標(biāo)題: 纖維素酶活力的測(cè)定方法 [打印本頁]
作者: 和興    時(shí)間: 2008-8-6 16:52
標(biāo)題: 纖維素酶活力的測(cè)定方法
1．纖維素酶的活力單位定義：
在50℃，pH為4.8條件下，每分鐘從濃度為10mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)活力單位（IU）。
2．測(cè)定原理
在50℃，pH為4.8條件下纖維素酶水解纖維素，產(chǎn)生分子量較小的聚合物和還原糖，還原糖可將3，5-二硝基水楊酸中的硝基還原成橙色的氨基化合物。利用比色法測(cè)出還原糖的量，從而計(jì)算出酶活力。
3．試劑和溶液
3．110.0mg/mL 的葡萄糖溶液
稱取的無水葡萄糖1.0000g加水溶解后定容至100mL。
3．20.05 mol/L的檸檬酸鹽酸性緩沖液
a、0.5mol/L檸檬酸溶液
準(zhǔn)確稱取105.0g檸檬酸完全溶解于800mL的蒸餾水中，定容至1000mL，標(biāo)記為A溶液；
b、0.5mol/L檸檬酸三鈉溶液
準(zhǔn)確稱取147.0g檸檬酸三鈉完全溶解于800mL的蒸餾水中，定容至1000mL，標(biāo)記為B溶液；
c、0.5mol/L的檸檬酸鈉緩沖液
取600mL的A液與1000mL的B液充分混勻，標(biāo)記為C液。
d、0.05mol/L的檸檬酸鹽酸性緩沖液（pH=4.80）
取C液1000mL加入到8000mL 的蒸餾水中，必要時(shí)用3mol/L的鹽酸溶液或3mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH為4.80，再定容10000mL，混勻后標(biāo)記為0.05mol/L的酸性緩沖液，同時(shí)標(biāo)記pH=4.80、配制日期。在4℃冰箱內(nèi)保存。
3．31.0％CMC底物
精密稱取羧甲基纖維素鈉1.0000g溶于80mL0.1mol/L的酸性緩沖液中，室溫下磁力攪拌至完全溶解(3小時(shí)以上)。用3mol/L鹽酸溶液或3mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為4.80，再用0.05mol/L的酸性緩沖液定容在100mL的容量瓶中。標(biāo)記為1.0%酸性羧甲基纖維素鈉溶液，同時(shí)標(biāo)記pH=4.80、配制日期。保存在4℃的冰箱內(nèi)。使用前恢復(fù)到室溫并搖均。
3．4DNS試劑
溶解10.0g 3，5-二硝基水楊酸、16g氫氧化鈉和300g酒石酸鉀鈉于約700mL蒸餾水中，加熱攪拌使完全溶解至澄清，放至常溫并定容至1000mL，置棕色試劑瓶中，暗處保存一個(gè)星期后使用。
4．儀器和設(shè)備
4．1 分析天平：感量0.0001g
4．2 精密pH計(jì)：精確至0.01
4．3 磁力加熱攪拌器
4．4 分光光度計(jì)：應(yīng)符合GB9721有關(guān)規(guī)定，5mm比色皿
4．5 電熱恒溫水浴鍋：30-100℃，±0.1℃
4．6 計(jì)時(shí)器：每小時(shí)誤差不超過五秒
4．7 移液器：100-1000μl
4．8 微樣進(jìn)量器：0-50μl
5．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取8支試管按下表加入試劑，稀釋葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液；再加入3mL DNS試劑。充分混勻置沸水中煮10min，水浴冷卻后，用0號(hào)試管做對(duì)照在540nm下測(cè)其它試液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
試管號(hào)
0
1
2
3
4
5
6
7
緩沖液加入量（μL）
500
490
480
475
470
465
460
455
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（μL）
0
10
20
25
30
35
40
45
葡萄糖含量（μg）
0
100
200
250
300
350
400
450
6．待測(cè)酶液的制備
精密稱取固體原酶粉1.0000g溶于80mL蒸餾水中（稀釋倍數(shù)≤100倍直接用緩沖液溶解）；室溫下磁力攪拌15min以上，用100mL容量瓶定容，離心后取上清液用緩沖液稀釋，使其吸光度在0.2-0.25之間。
7．水平控制液的制備
吸取1.0mL纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)液，（標(biāo)示酶活力為2500IU/Ml），用0.05mol/L的檸檬酸鹽酸性（pH=4.80）的緩沖液稀釋10000倍。新鮮水平控制液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
8．測(cè)定步驟
8．1 取三支試管各加入0.5mL底物，與待測(cè)酶液一起在50℃（±1℃）水浴中預(yù)熱5min。
8．2在第一、二試管中各加入0.5mL的待測(cè)酶液，50℃水浴中反應(yīng)10min。
8．3 在三支試管中各加入3mL 的DNS試劑，然后在第三支試管中加入0.5mL的待測(cè)酶液。
8．4搖勻三支試管后，在沸水浴中煮10min。
8．5水浴冷卻至室溫后，以第三支試管為對(duì)照在540nm條件下測(cè)第一、二支試管的吸光值。吸光值以0.2-0.25之間為宜，若不在此范圍內(nèi)可改變稀釋倍數(shù)重做。
9．結(jié)果計(jì)算
酶活力（IU/g或IU/mL）=（葡萄糖等量值/180/10/0.5）×n
式中：180指葡萄糖從微克換算成微克分子數(shù)
10指待測(cè)液與低物的反應(yīng)時(shí)間
0.5指低物反應(yīng)的待測(cè)酶液量
n指原酶液的稀釋倍數(shù)
10．允許分析結(jié)果可以接受標(biāo)準(zhǔn)：
10．1允許總分析誤差范圍，兩次取樣并且檢測(cè)結(jié)果相對(duì)誤差小于10%。
10．2水平控制檢測(cè)酶活力與標(biāo)準(zhǔn)酶活力誤差小于10%
10．3標(biāo)準(zhǔn)曲線至少由5點(diǎn)組成
作者: fjcwr    時(shí)間: 2008-8-10 14:30
這是國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法嗎?
作者: lichoushui    時(shí)間: 2009-9-1 09:54
問一下樓主DNS試劑為什么不加苯酚和亞硫酸鈉？這對(duì)酶活有沒影響？會(huì)不會(huì)影響顯色顏色？和國標(biāo)相差較大
作者: 游人學(xué)子    時(shí)間: 2009-9-1 16:02
？？？自主研發(fā)的方法嗎？還是廠家提供的？
作者: lichoushui    時(shí)間: 2009-9-3 13:31
不是啊
是QB2583-2003



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