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標(biāo)題: β-葡聚糖酶活力測(cè)定 [打印本頁]
作者: 和興    時(shí)間: 2008-8-6 16:53
標(biāo)題: β-葡聚糖酶活力測(cè)定
1．原理
在一定溫度和PH條件下β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖。產(chǎn)生的還原糖可將3，5-二硝基水楊酸中的硝基還原成橙色的氨基化合物，反應(yīng)液顏色強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖的量成正比，而還原糖生成量又與待測(cè)液的酶活力大小成正比。通過測(cè)定反應(yīng)液的吸光度，從而計(jì)算出待測(cè)液β-葡聚糖酶活力。
2．試劑和溶液：
2．110.0mg/ml的葡萄糖溶液
稱取無水葡萄糖1.0000g加水溶解后定容至100ml。
2．20.05mol/L檸檬酸鹽酸性緩沖液
a、0.5mol/L的檸檬酸溶液：
準(zhǔn)確稱取105.0g檸檬酸完全溶于800ml的蒸餾水中，定容至1000ml。標(biāo)記為A試液.
b、0.5mol/L的檸檬酸三鈉溶液：
準(zhǔn)確稱取147.0g檸檬酸三鈉完全溶于800ml的蒸餾水中，定容至1000ml。標(biāo)記為B試液.
c、0.5mol/L的檸檬酸鈉緩沖液：
取600ml的A試液與1000ml的B試液充分混勻。標(biāo)記為C試液.
d、0.05mol/L的檸檬酸鹽酸性緩沖液（pH 4.80）：
取C試液1000ml加入到8000ml的蒸餾水中。用PH計(jì)檢測(cè)其PH值，必要時(shí)用3mol/L的鹽酸溶液或3mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH值為4.80。再定容至10000ml?；靹蚝髽?biāo)記為0.05mol/L酸性緩沖液,同時(shí)標(biāo)記pH=4.80、配制日期。在4℃冰箱內(nèi)保存。
2．31.0%β-葡聚糖底物：
精密稱取β-葡聚糖1.0000g溶于100mL 0.05mol/L的酸性緩沖液中，磁力攪拌至完全溶解（室溫下3小時(shí)以上）。用3mol/L鹽酸溶液或3mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為4.80，再用0.05mol/L的酸性緩沖液定容在100 mL的容量瓶中。標(biāo)記為1.0%β-葡聚糖酸性溶液，同時(shí)標(biāo)記pH=4.80、配制日期。保存在4℃的冰箱內(nèi)。使用前恢復(fù)到室溫，并搖勻。
2．4DNS試劑
溶解10.0g3,5—二硝基水揚(yáng)酸，16.0g氫氧化鈉和300.00g酒石酸鉀鈉于約700 mL蒸餾水中，加熱攪拌使完全溶解至澄清，放至常溫并用蒸餾水定容至1000 mL,置棕色試劑瓶中，暗處保存一個(gè)星期后使用。
3．儀器和設(shè)備：
3．1 分析天平：感量0.0001g
3．2 精密pH計(jì)：精確至0.01
3．3 磁力加熱攪拌器
3．4分光光度計(jì)：應(yīng)符合GB9721有關(guān)規(guī)定，5mm比色皿
3．5電熱恒溫水浴鍋：30—100℃，±0.1℃
3．6 計(jì)時(shí)器：每小時(shí)誤差不超過五秒
3．7 移液器：100—1000μl
3．8 微量進(jìn)樣器：0-50μl
4．分析步驟：
4．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
取8支試管按下表加入試劑，稀釋葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液；再加入3 mL DNS試劑。充分混勻置沸水中煮5min。水浴冷卻后，用0號(hào)試管作對(duì)照在540nm下測(cè)其他試液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
試管號(hào)
0
1
2
3
4
5
6
7
緩沖液加入量
（μL ）
1000
990
980
975
970
965
960
955
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入量
（μL）
0
10
20
25
30
35
40
45
葡萄糖含量
（μg）
0
100
200
250
300
350
400
450
4．2 待測(cè)酶液的制備：
4．2．1液體酶：用緩沖液稀釋原酶液，使其吸光度（OD值）在0.20— 0.25之間。
4．2．2 固體酶：精密稱取固體原酶粉1.0000g溶于80ml蒸餾水中（稀釋倍數(shù)≤100倍的直接用緩沖液溶解）；室溫下磁力攪拌15min以上；用100ml容量瓶定容。離心后取清液用緩沖液稀釋，使其吸光度在0.20— 0.25之間。
4．3 水平控制：
用已知酶活力的標(biāo)準(zhǔn)樣作水平檢查。
4．4 活力的測(cè)定：
4．4．1 取三支試管各加入0.5ml底物，與待測(cè)酶液一起在50℃（±1℃）水浴中預(yù)熱5min。
4．4．2 在第一、二試管中各加入0.5ml待測(cè)酶液，40℃水浴中反應(yīng)10min。
4．4．3 在三支試管中各加入3ml的DNS試劑，然后在第三支試管中加入0.5ml的待測(cè)酶液
4．4．4 搖勻三支試管后，在沸水浴中煮5min。
4．4．5 水浴冷卻至室溫后，以第三支試管為對(duì)照在540nm條件下測(cè)第一、二試管樣的吸光值。吸光值以在0.20— 0.25之間為宜，若不在此范圍可改變稀釋倍數(shù)重做。
5．酶活力的計(jì)算：
酶活力（IU/mL或IU/g）= (葡萄糖等量值/180/10/0.5）×n
式中：180指葡萄糖從微克換算成微克分子數(shù)
10指待測(cè)液與底物的反應(yīng)時(shí)間
0.5指與底物反應(yīng)的待測(cè)酶液量
n指原酶液（或固體原酶）的稀釋倍數(shù)
6．允許分析結(jié)果可以接受標(biāo)準(zhǔn)：
6．1 允許總分析誤差范圍，兩次取樣并且檢測(cè)結(jié)果相對(duì)誤差小于10%。
6．2 水平控制檢測(cè)酶活力與標(biāo)準(zhǔn)活力相對(duì)誤差小于10%。
6．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線至少由5點(diǎn)組成



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