畜牧人

標(biāo)題: 飼料中粗蛋白測(cè)定方法 [打印本頁(yè)]
作者: 泡泡    時(shí)間: 2008-9-26 09:39
標(biāo)題: 飼料中粗蛋白測(cè)定方法


1、凱氏定氮法的原理
1.1 消化：樣品與硫酸一同加熱消化，硫酸使有機(jī)物脫水，破壞有機(jī)物，有機(jī)物中的碳和氫氧化為二氧化碳和水逸出，而蛋白質(zhì)分解成氨，則與硫酸結(jié)合成硫酸銨留在酸性溶液中。其反應(yīng)式如下：
H2SO4→SO2+H2O+﹝O﹞
2CH3.CH.NH2.COOH+2﹝O﹞→2CH3.CHOH-NH2+2CO2
2CH3.CHOH.NH2+10﹝O﹞→4CO2+2NH3+4H2O
2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4
在消化過(guò)程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機(jī)物分解，它與硫酸反應(yīng)生成硫酸鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸加熱沸點(diǎn)330℃，而添加硫酸鉀后，溫度可達(dá)400℃，加速了整過(guò)反應(yīng)的過(guò)程。此外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來(lái)提高沸點(diǎn)。其理由隨著消化過(guò)程硫酸的不斷的分解，水分的逸出而是硫酸鉀濃度增大，沸點(diǎn)增加。加速了有機(jī)物的分解。其反應(yīng)式如下：
K2SO4+H2SO4=2KHSO4
2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3
但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度過(guò)高，生成硫酸銨也會(huì)分解，放出氨而造成損失。
（NH4）2SO4→NH3↑+NH4HSO4
2 NH4HSO4→2 NH3↑+2 SO4↑+2H2O
為了加速反應(yīng)過(guò)程，還加入硫酸銅，氨化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過(guò)氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑，但為了防止污染通常使用硫酸銅，其反應(yīng)式如下：
2GuSO4→Gu2SO4+ SO2↑+O2↑
5O2+2GuSO4→GuSO4+ SO2↑+6O2↑
GuSO4+H2SO4→2GuSO4+ SO2↑+H2O
所以有機(jī)物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的藍(lán)綠色，它具體由催化功能，還可以作為堿性反應(yīng)指示劑。
1.2
蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這一操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過(guò)量；二是防止樣液中氨氣逸出，其反應(yīng)如下：
2（NH4）2SO4+2NaOH→NH3↑+Na2SO4+H2O
1.3
吸收與滴定：蒸餾過(guò)程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或鹽酸溶液進(jìn)行吸收。然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過(guò)剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計(jì)算出總氨量。半微量或微量蒸餾定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液之間滴定，硼酸呈微弱的酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用，其反應(yīng)如下：
2NH3+4H3BO3→（NH4）2B4O7+5 H2O
（NH4）2B4O7+2HCI+5 H2O→2NH4CL+4H3BO3
1.4 混合指示劑：標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定吸收液中的氨的PH值突躍范圍為6.3-4.3。采用甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，終點(diǎn)顏色由綠色變?yōu)榛壹t色。

PH＜5.1
PH=5.1
PH＞5.1
溴甲酚綠
黃色
綠色
藍(lán)色
甲基紅
紅色
橙色
黃色
甲基紅+溴甲酚綠
酒紅色
灰色
藍(lán)綠色
2、定氮儀
2.1 對(duì)半微量定氮儀的要求：必須是水蒸氣蒸餾，蒸餾速度為10-20分鐘內(nèi)蒸出液量達(dá)70-100毫升，氨的回收率在97%以上，一起加堿空蒸時(shí)，蒸出液空白要低。
2.2 操作定氮儀注意事項(xiàng)：
2.2.1本儀器必須在無(wú)氮及氨化物污染的專用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作。
2.2.2所有的蒸餾水均為無(wú)氨水。
2.2.3蒸餾試樣前必須清洗儀器，并對(duì)儀器進(jìn)行檢漏。
2.2.4新的蒸餾裝置或久不使用的裝置，冷凝管不要通冷凝水，先通水蒸氣洗凈。
2.2.5在分析試樣前，蒸餾50毫升水溶液檢查空白，空白低時(shí)才能進(jìn)行試樣分析。
3、飼料粗蛋白測(cè)定方法操作注意點(diǎn)
3.1試樣消煮，加催化劑［GuSO4.5 H2O:Na2SO4(無(wú)水)=1:15(質(zhì)量比)］3.2克、加濃硫酸13毫升。
3.2 消化時(shí)間視不同樣品含脂肪、蛋白質(zhì)而定，一般樣液呈現(xiàn)藍(lán)綠色后消化30分鐘就可以（高蛋白及有爭(zhēng)議的樣品應(yīng)按國(guó)標(biāo)消化至樣液出現(xiàn)藍(lán)綠色后消化2小時(shí)。
3.3 無(wú)損失的將消化液由凱氏燒瓶轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，并用蒸餾水洗凱氏燒瓶2-3次，洗液一并倒入容量瓶中。
3.4 配置的20g/l硼酸液不能被酸污染，三角燒瓶應(yīng)洗凈，一旦顯色不對(duì)，洗凈后重新吸取硼酸液和指示劑。
3.5 加蒸餾水空蒸，一要對(duì)定氮儀檢漏；二要檢蒸餾液的ＰＨ值不能太高，最好控制在ＰＨ值６－７之間。
3.6 要先塞好入口玻璃塞，再加堿液，小心提起玻塞使之流入反應(yīng)室，將玻璃塞塞好，且在入口出加水封好。防止氨損失和漏氣。同時(shí)要嚴(yán)防反應(yīng)室里分解試樣和堿液倒吸出來(lái)。反應(yīng)室內(nèi)液量不能太多。
3.7 控制好水蒸氣發(fā)生器溫度，不能過(guò)高（測(cè)定結(jié)果偏高）；不能過(guò)低（測(cè)定結(jié)果偏低）。可用一臺(tái)調(diào)壓器與電爐串聯(lián)，以硫酸銨校正值確定電壓大小。
3.8 應(yīng)隨時(shí)用分析純硫酸銨代替試樣來(lái)校正加堿，蒸餾和滴定各步驟地操作。
3.9 蒸餾完畢，拔入口處玻璃塞動(dòng)作要輕柔。防止反應(yīng)室內(nèi)堿液倒噴入冷凝管內(nèi)，避免給下一個(gè)試樣分析帶來(lái)較大的誤差。
3.10 滴定操作禁止放長(zhǎng)線滴定。
3.11 每換一批藥品試劑、標(biāo)液要用蔗糖（分析純）代替試樣進(jìn)行空白測(cè)定。
3.12 消化溫度應(yīng)控制在400℃至420℃內(nèi)。消化器控溫器應(yīng)良好，電阻絲應(yīng)使用專用配套電阻絲，拉伸應(yīng)均勻，使?fàn)t內(nèi)溫度均勻，沒(méi)有房消化管的孔上用瓷坩堝蓋蓋上。
CP(%)＝(V2-V1)×C×0.014×6.25×100 /W×V1／V
式中：V2—滴定試樣時(shí)所需酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；
V1—滴定空白時(shí)所需酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；
C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；
W—試樣重量g；
V—試樣分解液總體積，ml；
V1—試樣分解液蒸餾用體積，ml；
0.014—氨的摩爾質(zhì)量g/m mol；
6.25—氨換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。
在實(shí)際分析應(yīng)用中通常V1=0.1 ml
V=100 ml如若C（HCL）=0.0493 mol/ ml
V1=5 ml
那么粗蛋白質(zhì)計(jì)算公式可簡(jiǎn)化為：
CP(%)＝(V2-0.10)×0.0493×0.014×6.25×100 /W×5／100
作者: 薛店    時(shí)間: 2009-2-21 16:47
這兩天做蛋白實(shí)在是在郁悶了，痛苦，難受！‘
作者: 和興    時(shí)間: 2009-2-21 16:52
資料很詳細(xì)，不過(guò)消化的過(guò)程，我們很久不用你文中的方法了，改用濃硫酸加過(guò)氧化氫可縮短樣品的消化過(guò)程。要知道，飼料的檢測(cè)不但要準(zhǔn)確，而且要快速??！
作者: 泡泡    時(shí)間: 2009-2-21 22:48
2# 薛店
測(cè)蛋白的時(shí)候是會(huì)覺(jué)得很枯燥的，不過(guò)堅(jiān)持就是勝利
作者: 泡泡    時(shí)間: 2009-2-21 22:49
3# 和興 請(qǐng)問(wèn)您，用您這樣的方法消化的過(guò)程大概需要多少時(shí)間？
作者: xiaoliangqiu    時(shí)間: 2009-3-31 16:31
樓主辛苦啦，說(shuō)得很詳細(xì)。消化過(guò)程是先低溫再高溫，還是直接高溫400度左右好呢？
作者: 泡泡    時(shí)間: 2009-4-3 09:08
6# xiaoliangqiu 當(dāng)然是從低到高了，直接上400°你想象一下會(huì)有什么效果？
作者: 微塵    時(shí)間: 2009-4-3 15:51
現(xiàn)在消化也就1個(gè)小時(shí)左右
作者: 客家人    時(shí)間: 2009-4-24 18:35
資料很詳細(xì)，不過(guò)消化的過(guò)程，我們很久不用你文中的方法了，改用濃硫酸加過(guò)氧化氫可縮短樣品的消化過(guò)程。

具體怎么樣的一個(gè)操作呢?請(qǐng)明示!!謝謝
作者: hdy198    時(shí)間: 2009-4-24 19:42
,目前,低蛋白測(cè)定一批樣大約1小時(shí)40分鐘,高蛋白的就要更長(zhǎng)時(shí)間消化,若大家有好的準(zhǔn)確快速方法都來(lái)分享討論吧!
作者: binxue166    時(shí)間: 2009-4-27 16:16
,目前,低蛋白測(cè)定一批樣大約1小時(shí)40分鐘,高蛋白的就要更長(zhǎng)時(shí)間消化,若大家有好的準(zhǔn)確快速方法都來(lái)分享討論吧!
hdy198 發(fā)表于 2009-4-24 19:42

買個(gè)半自動(dòng)的蛋白消化儀會(huì)節(jié)省很多時(shí)間，消化大概45-60分鐘，蒸餾才幾分鐘，有4、6、8、12管幾種不同規(guī)格的，國(guó)產(chǎn)的幾千塊錢一套（消化儀+蒸餾儀）。
作者: zhangxm    時(shí)間: 2009-4-28 09:03
我還沒(méi)有做過(guò)用過(guò)氧化氫呢，能說(shuō)一下具體的操作方法嗎
作者: zhanghongquan    時(shí)間: 2009-4-28 09:23
現(xiàn)在做蛋白時(shí)用消化爐加定氮儀就很快了，一般做一個(gè)蛋白需要3個(gè)小時(shí)就足夠了，操作簡(jiǎn)單方便，關(guān)鍵控制點(diǎn) 餓很容易掌握
作者: xipuzl825168439    時(shí)間: 2009-10-17 11:03
希望大家繼續(xù)討論，前面的提到的好的方法快寫上來(lái)吧，讓大家也好學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)呀！
作者: shaopeng_wei    時(shí)間: 2010-6-1 13:43
很詳細(xì)，補(bǔ)充一點(diǎn)：
    向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí)，往往出現(xiàn)褐色沉淀無(wú)。這時(shí)由于分解促進(jìn)劑與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時(shí)Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。
作者: jnstyq    時(shí)間: 2010-6-1 17:15
我們有測(cè)量粗蛋白用的定氮儀，若感興趣可以加我的qq：1243338573
作者: zhengshi2006gd    時(shí)間: 2010-6-10 11:38
我還從來(lái)沒(méi)用過(guò)過(guò)氧化氫做催化劑呢！能明示詳細(xì)方法嗎？
作者: 極限天空    時(shí)間: 2010-6-10 18:49
我們消化的時(shí)候用消化儀，蒸餾的時(shí)候用半微量。
作者: tanghongjun1988    時(shí)間: 2011-3-3 22:02
回復(fù) 和興 的帖子

這位同仁，可以詳細(xì)介紹一下加過(guò)氧化氫的檢測(cè)方法嗎
可以的話，分享一下檢測(cè)步驟？
作者: 小小書童    時(shí)間: 2011-3-4 20:31
回復(fù) 和興 的帖子

你們用的是什么方法檢測(cè)蛋白
能不能介紹一下





歡迎光臨 畜牧人 (http://www.ffers.com.cn/) Powered by Discuz! X3.5