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畜牧人
標(biāo)題:
轉(zhuǎn) 廣西野豬豬瘟病毒感染情況的調(diào)查報(bào)告
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作者:
zhangyunCCIC
時(shí)間:
2008-12-9 13:53
標(biāo)題:
轉(zhuǎn) 廣西野豬豬瘟病毒感染情況的調(diào)查報(bào)告
廣西野豬豬瘟病毒感染情況的調(diào)查報(bào)告
陳鳳蓮
,
馬玲
,
潘漢世
,
黃紅梅
,
孫建華
,
陳忠偉
,
吳健敏
(
廣西獸醫(yī)研究所
,
南寧
530001)
摘要
:
作者報(bào)道采用
RT-PCR
和
ELISA
方法檢測(cè)豬瘟病毒在野豬身上的感染情況。采集廣西
5
個(gè)地市
28
份野豬脾淋組
織作病毒檢測(cè)
,
設(shè)計(jì)針對(duì)豬瘟
(classical swine fever, CSF)
病毒的特異性引物
CSFVE2,
進(jìn)行
RT-PCR
檢測(cè)
,
所檢樣品結(jié)果全呈
豬瘟陰性
;
同時(shí)
,
運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定
(ELISA)
試劑盒檢測(cè)以上樣品
,
結(jié)果也都呈陰性。這一結(jié)果初步表明所檢測(cè)的廣西
5
個(gè)地區(qū)的野豬沒有感染豬瘟病毒。
關(guān)鍵詞
:
豬瘟病毒
;
野豬
;RT-PCR;ELISA
中圖分類號(hào)
:S852.65+1
文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼
:A
文章編號(hào)
:1671-7236(2007)08-0075-03
野豬
( sus scrofa)
屬于偶蹄目
,
豬科
,
主要分布在歐亞大陸的南部
,
即分布于歐洲、北非和亞洲中
部天山山脈的歐洲野豬
,
分布于中國大陸、臺(tái)灣、爪哇、蘇門答臘和新幾內(nèi)亞的亞洲野豬。近年來
,
由于野豬獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而備受親睞
,
野豬資源也逐漸受到保護(hù)
,
如廣東已將野豬列為省重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。但是
,
除了對(duì)野豬生態(tài)學(xué)和利用方面研究較多外
,
對(duì)其疾病及其在森林生態(tài)環(huán)境中疾病控制方面的研究報(bào)道甚少。
豬瘟
(classical swine fever ,CSF)
是嚴(yán)重危害
全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病
,
是我國主要的畜禽疫病之一。近年來本病以多種形式發(fā)生
,
非典型豬瘟
(
雷夢(mèng)珍
,1995)
、繁殖障礙、新生仔豬先天性感染
(
王雯慧等
,2000)
等
,
給本病的診斷與防控帶來很大的困難。野豬是豬瘟病毒的自然貯存宿主
,
野豬中存在
CSFV
的持續(xù)感染
,
目前為止仍然是歐盟國家爆發(fā)豬瘟的最重要傳染源
(
涂長(zhǎng)春
,2003),
因而也是歐盟各國控制消滅
CSFV
首要考慮的因素之一。我國野豬資源豐富
,
目前為止尚未見到開展野豬感染豬瘟的調(diào)查報(bào)道
,
因此我國野豬中是否也存在
CSFV
感染
,
是豬瘟防控工作中急待了解的問題。因此
,
開展野豬中
CSFV
感染的情況調(diào)查
,
對(duì)我們了解
CS-FV
的生態(tài)環(huán)境
,
制定
CSFV
的控制與凈化措施
,
開發(fā)野豬資源等都具有十分重要的意義。本試驗(yàn)用
RT-PCR
技術(shù)和
ELISA
方法檢測(cè)來自廣西境內(nèi)
5
個(gè)山區(qū)市縣的
28
份野豬組織材料
,
以了解廣西境內(nèi)野豬
CSFV
的感染情況
,
現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下
:
1
材料和方法
1.1
野豬檢測(cè)材料
2006
年采自廣西崇左、河池、柳州、百色、梧州
5
個(gè)市
(
縣
)
野外捕殺野豬的脾臟與淋巴結(jié)
,
共
28
份
(
其中有
3
份為
1998
年采集
,
來自百色田林縣
)
。
1.2
主要試劑
M-MLV
反轉(zhuǎn)錄酶、
TaqDNA
聚合酶購自
Promega
公司
;Trizol
購自
Invitrogen
公司
; dNTPs
、
DL2000 DNA Marker
、
RNasin
等購自
TaKaRa
公司。豬瘟抗原檢測(cè)試劑盒
(ELISA
檢測(cè)試劑盒
)
為美國
IDEXX
公司產(chǎn)品。
1.3
引物合成 根據(jù)已發(fā)表的
CSFV Alfort
株的
E2
基因序列
(Meyers
等
,1996),
設(shè)計(jì)了
1
對(duì)簡(jiǎn)并引
物
:CSFV-F:5
’
-TC(GA)(AT)CAACCAA(TC) GAGATAGGG-3’;CSFV-R:5’-CACAG(CT)CC (AG)AA(TC)CC(AG)AAGTCATC
-3
’
,
預(yù)期擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度約為
216 bp
。由北京博邁德生物技
術(shù)有限責(zé)任公司合成。
1.4
材料中總
RNA
的抽提 取大約
1 g
上述野豬脾、淋組織
,
于研磨器充分研磨
,
用
Hanks
液
1
∶
5
稀釋
,
反復(fù)凍融
3
次
,8000 r/min
離心
10 min,
取上清液
400
μ
l,
加入
800
μ
l Trizol,
混勻后室溫放置
5 min
。加入
200
μ
l
氯仿
,
旋渦振蕩
15 s
混勻
,
室溫下放置
2~3 min,12000 r/min
離心
10 min
。取上
清轉(zhuǎn)移到新的
EP
管
,
再加入
500
μ
l
異丙醇混勻
,
室溫下放置
10 min
。
12000 r/min
離心
10 min,
棄上
清
,
再加入
75%
酒精
1000
μ
l,
旋渦振蕩混勻
,12000r/min
離心
5 min,
晾干
,
用適量無
Rnase
水溶解
RNA,
-20
℃
凍存?zhèn)溆谩?/font>
1.5
病毒
cDNA
合成 取
16
μ
l
上述
RNA
與
1
μ
lCSFV-R
引物混勻
,
于
PCR
儀中
70
℃
5 min,
90
℃
5 min
后
,
立即冰浴
5 min
。在上液中加入如下試劑
:5
×
RT buffer 5
μ
l,dNTP ( 2.5 mmol/L) 4
μ
l, RNasin 0.5
μ
l, M-MLV
反轉(zhuǎn)錄酶
0.5
μ
l,
混勻后置
PCR
儀中
42
℃
反轉(zhuǎn)錄
1 h
后于
-20
℃
保存?zhèn)溆谩?/font>
1.6
CSFVE2
基因片段的擴(kuò)增
PCR
反應(yīng)體系為
25
μ
l ,
各成分如下
:10
×
PCR buffer 2.5
μ
l,dNTP
(2.5 mmol/L) 2.5
μ
l,CSFV-F
和
CSFV-R(2.5pmol/L)
各
0.5
μ
l,cDNA
模板
2.0
μ
l,0.25
μ
TaqDNA
聚合酶
(5 U/ul),
加
H2O
至
25
μ
l
。
PCR
反應(yīng)程序?yàn)?/font>
:
94
℃
預(yù)變性
3 min;
94
℃
1 min,
56
℃
1 min,
72
℃
1 min,35
個(gè)循環(huán)
;
72
℃
延伸
5 min
。反應(yīng)結(jié)束后取
5
μ
l PCR
產(chǎn)物在
1.5%
瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳
,
在凝膠成像系統(tǒng)上觀察目的片段。
1.7
ELISA
方法檢測(cè)豬瘟抗原 除了選用其中
20
份野豬脾、淋組織外
,
還選取了
3
份由本室保存的豬瘟陽性病料一同進(jìn)行檢測(cè)。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。首先在每孔中加入
25
μ
l CSFV
特異性單克隆抗體
;
然后再加入
75
μ
l
制備的樣品
,
混勻
;
置濕盒
,
室溫孵育過夜
;
用洗滌液洗滌
5
次后
,
在每孔中加入
100
μ
l
辣根過氧化物酶標(biāo)記物
,
濕盒中孵育
1 h;
再用洗滌液洗滌
5
次
,
于每孔加入
100
μ
l
底物液
,
在暗處室溫孵育
10 min
后
,
每孔加入
100
μ
l
終止液終止反應(yīng)
,
最后在酶標(biāo)儀上測(cè)量樣品在
450 nm
處的
OD
值。本試驗(yàn)設(shè)立
2
孔陰、陽性對(duì)照。結(jié)果判定
:
被檢樣品校正
OD
值≥
0.300,
判為陽性
;
校正
OD
值
<0.200
判為陰性
;
校正
OD
值在
0.200~0.300
之間判為可疑。
OD
值校正方法見說明書。
2
結(jié)果
2.1
RT-PCR
對(duì)野豬脾、淋組織的檢測(cè)結(jié)果 采用
RT-PCR
技術(shù)
,
利用
CSFV
特異性引物
,
對(duì)
5
個(gè)地區(qū)
28
份野豬材料及
2
份豬瘟陽性病料進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果陽性對(duì)照在約
216 bp
處擴(kuò)增出
CSFVE2
基因目的片段
,
而所有被檢野豬組織均沒有擴(kuò)增出
CSFV
目的片段
,
初步表明所檢測(cè)的野豬被檢樣品沒有檢測(cè)到
CSFV(
圖
1
為部分被檢樣品結(jié)果
)
。
2.2
ELISA
方法對(duì)野豬組織樣品的檢測(cè)結(jié)果 為
了進(jìn)一步驗(yàn)證上述
RT-PCR
的檢測(cè)結(jié)果
,
再采用美國
IDEXX
公司豬瘟
ELISA
抗原檢測(cè)試劑盒
,
對(duì)野
豬樣品進(jìn)行檢測(cè)
,
結(jié)果除了
3
份豬瘟陽性病料檢測(cè)的
OD
值大于
0.3
以外
,
其余
20
份野豬材料檢測(cè)的
OD
值均小于
0.2(
表
1),CSFV
檢測(cè)陰性。由此進(jìn)一步說明這些野豬沒有受到
CSFV
感染。
3
討論與小結(jié)
國外有報(bào)道
(Kaden
等
,1999)
認(rèn)為在豬瘟病毒的檢測(cè)方法中
,RT-PCR
和病毒分離是目前敏感性
較高的試驗(yàn)方法
,ELISA
診斷方法次之。由于病毒分離的試驗(yàn)周期較長(zhǎng)
,
且成功率不高
,
所以目前多采用
RT-PCR
。本試驗(yàn)在運(yùn)用
RT-PCR
檢測(cè)的基礎(chǔ)上
,
再用
IDEXX
公司豬瘟
Ag-ELISA
檢測(cè)試劑盒
,
對(duì)來自廣西
5
個(gè)山區(qū)市
(
縣
)
的
28
份野豬材料進(jìn)行檢測(cè)
,
結(jié)果全部為陰性
,2
種檢測(cè)方法結(jié)果一致
,
初
步說明廣西這些區(qū)域的野豬
(
野生
)
沒有受到
CSFV
的感染。豬瘟是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一
,
是世界各國重點(diǎn)防制的動(dòng)物疫病。每年都投入巨大的防制經(jīng)費(fèi)
,
制定并采取嚴(yán)密的防控措施。我國是豬瘟的老疫區(qū)
,
豬瘟的問題長(zhǎng)期困擾著我國的養(yǎng)豬業(yè)
,
如何控制凈化豬瘟病毒是擺在我們面前一個(gè)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)。涂長(zhǎng)春課題組經(jīng)過大量艱苦細(xì)致的工作
,
發(fā)現(xiàn)我國豬瘟病毒的流行毒株分為
2
個(gè)基因群
,
4
個(gè)基因亞群
,
其中基因
2
群屬優(yōu)勢(shì)基因群
,
它們與歐洲流行的
2
群病毒甚至和流行于歐洲野豬群中的毒株在遺傳上有親緣關(guān)系。但到目前為止
,
我國野豬中是否存在豬瘟病毒感染仍未見報(bào)道。盡管本試驗(yàn)因條件限制
,
采樣地區(qū)狹小
,
樣品數(shù)量有限
,
但也能反映一定的問題。因此
,
我們的調(diào)查結(jié)果
不但豐富了我國豬瘟病毒流行病學(xué)、生態(tài)環(huán)境的資料
,
而且對(duì)制定豬瘟控制與凈化措施具有重要
的指導(dǎo)作用。
參考文獻(xiàn)
1
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Kaden V, Steyer H, Strebelow G, et al. Detection of low-viru-lent classical swine fever virus in blood of experimentally infectedanimals: comparison of different methods[J]. Acta Virol, 1999, 43(6):373~380.
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5
Meyers G, et al. Molecular cloning and nucleotide sequecneof the genome of hog cholera virus[J]. Virol, 1996,171:555~567.
作者:
一人立刀
時(shí)間:
2009-3-8 00:47
這是07年的嗎？有沒有近期的文章呢
作者:
tian11aiguo
時(shí)間:
2009-9-8 08:21
野豬沒有感染豬瘟野毒，很有意思的一件事情，豬瘟野毒的基因群？？？
作者:
gonghao848
時(shí)間:
2009-9-11 14:14
原來野豬也會(huì)感染病毒的阿
歡迎光臨 畜牧人 (http://www.ffers.com.cn/)
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