畜牧人
標(biāo)題:
副豬嗜血桿菌的分離鑒定
[打印本頁(yè)]
作者:
bluewing2003
時(shí)間:
2009-5-8 10:28
標(biāo)題:
副豬嗜血桿菌的分離鑒定
副豬嗜血桿菌（
HPS
）引起豬的多發(fā)性漿膜炎與關(guān)節(jié)炎，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征
,
我國(guó)以血清
4
型和
5
型最為流行，其次為
13
型、
14
型和
12
型
。
下面就如何分離鑒定
HPS
做一個(gè)闡述
。
一
、
病原菌的分離、鑒定
無(wú)菌操作從疑似病豬的鼻腔、肺臟、胸膜、胸腹腔積水、心包積液、心血、關(guān)節(jié)液和腦組織等病料中取樣，在無(wú)菌操作臺(tái)上，用接種環(huán)分別挑取上述可疑菌的單菌落，水平劃線于無(wú)NAD的綿羊鮮血平皿上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37℃培養(yǎng)24-48h，看是否有“衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象”（即在葡萄球菌菌苔附近待測(cè)菌菌落生長(zhǎng)較大，而遠(yuǎn)側(cè)菌落生長(zhǎng)較小甚至沒(méi)有菌落生長(zhǎng)），同時(shí)觀察是否具有溶血現(xiàn)象。取具有“衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象”且不溶血的單菌落純培養(yǎng)后接種于脲酶、氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等微型生化鑒定管，按廠家說(shuō)明書(shū)的方法操作并觀察結(jié)果。
二、結(jié)果判定
副豬嗜血桿菌
在綿羊鮮血瓊脂平板上與金黃色葡萄球菌交叉劃線，
37
℃培養(yǎng)
24~48h
后，呈現(xiàn)典型的“衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象”，即越靠近葡萄球菌的周?chē)渖L(zhǎng)越好，遠(yuǎn)離葡萄球菌的地方不生長(zhǎng)，并且在鮮血瓊脂平板上的副豬嗜血桿菌菌落周?chē)怀霈F(xiàn)溶血現(xiàn)象。
將副豬嗜血桿菌接種于微量生化鑒定管，
37
℃培養(yǎng)
48h
后，結(jié)果為
脲酶試驗(yàn)陰性，氧化酶試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)陰性并發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等碳水化合物
生化鑒定項(xiàng)目
HS79(4
型標(biāo)準(zhǔn)菌
)
HS80(5
型標(biāo)準(zhǔn)菌
)
NAD-
依賴(lài)性
+
+
溶血性
-
-
脲酶
-
-
硝酸鹽還原
+
+
吲哚
-
-
氧化酶
-
-
接觸酶
+
+
葡萄糖
+
+
麥芽糖
+
+
蔗糖
+
+
果糖
+
+
核糖
+
+
半乳糖
+
+
三
、分子生物學(xué)
檢測(cè)
(PCR)
將被檢菌株菌液
10,000r/min
離心
5min
，棄上清液，用無(wú)菌水懸浮，渦旋后，于沸水中水浴
10min
后，再放置
-20℃
凍結(jié)。凍融后
10,000r/min
離心
5min
，取上清液作模板?；?qū)⒎蛛x純化的菌株用接種環(huán)刮取
2
個(gè)菌落洗脫于含
100µl
無(wú)菌水的離心管中，再同上渦旋，水浴，凍融及離心作模板。
根據(jù)副豬嗜血桿菌
16S rRNA
（
M75065
）
序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工公司合成：
上游引物：
5’-GGC TTC GTC ACC CTC TGT –3
下游引物：
5’-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT –3
反應(yīng)體系（
50
µl
）：
10
倍緩沖液
5
µl
，
25mmol/L MgCl2 1.5
µl
，
dNTPs 1.0
µl
，
1.5umol/L
上游引物
1.5
µl
，
1.5umol/L
下游引物
1.5
µl
,
ExTaqE
0.5
µl
，滅菌雙蒸水
9
µl
，模板
10
µl
。反應(yīng)條件：
94
℃變性
4min
；
94
℃
50s
，
59
℃
50s
，
72
℃
1min
，
72
℃
10min
，
PCR
產(chǎn)物
4
℃保存。
四、結(jié)果判定
根據(jù)副豬嗜血桿菌
16S rRNA
序列設(shè)計(jì)引物經(jīng)
PCR
擴(kuò)增的產(chǎn)物為
822 bp
大小的片段。
作者:
潲水娃
時(shí)間:
2009-5-8 22:01
好高深莫測(cè)，看不懂
歡迎光臨 畜牧人 (http://www.ffers.com.cn/)
Powered by Discuz! X3.5