畜牧人
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豬病實驗室常規(guī)診斷技術(shù)之 十二、豬細小病毒檢測方法
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作者:
nnii521
時間:
2009-6-24 21:19
標題:
豬病實驗室常規(guī)診斷技術(shù)之 十二、豬細小病毒檢測方法
十二、豬細小病毒檢測方法
豬細小病毒血凝抑制試驗操作方法
（一）材料準備
1
．抗原：
豬細小病毒濃縮抗原
2
．
PPV
陽性及陰性血清
3
．被檢血清：
自被檢豬的前腔靜脈血或自耳靜脈采血分離血清。
4
．紅細胞：
按抗凝劑與血液
1
：
4
的比例心臟采集豚鼠血液，用
PBS
洗三次，沉積紅細胞配成
0.5%
懸液備。
5
．稀釋液：
用滅菌的
PH7.2
磷酸鹽緩沖液（
PBS
）。
6
．
25%
白陶土：
取白陶土
25
克
，置離心瓶中，加入適量
1mol/L
鹽酸溶液，充分攪勻，
2 000
轉(zhuǎn)
/
分鐘離心
10
分鐘，棄上清，再加
1mol/L
鹽酸溶液，攪勻，離心，反復(fù)洗三次，沉淀白陶土，用
0.15mol/L
生理鹽水
100
毫升配成
25%
懸液，然后用
5mol/L
氫氧化鈉溶液調(diào)
p
H7.2
左右
,
高壓滅菌
,
置
4
℃
備用
,
保存期不超過半年。
7
．器材：
96
孔
U
型滴定板或
V
型滴定板，
25
微升稀釋棒，
25
微升滴管，微量振蕩器，普通離心機。
（一）
試驗操作
HA
：
用滴管在滴定板上從第一孔至試驗所需稀釋倍數(shù)孔，每孔滴加稀釋液
25
微升于第一孔再滴加抗原
25
微升，用稀釋棒從第一孔開始依次稀釋。置微量振蕩器上振蕩
15
秒，最后每孔滴加
0.5%
豚鼠紅細胞
25
微升，振蕩
30
分鐘，置室
1
小時判定并記錄結(jié)果。
HI
：
用滴管在滴定板上從第一孔至所需稀釋倍數(shù)孔各加稀釋液
25
微升，于第一孔滴加被檢測血清
25
微升，然后每孔加
4
單位抗原
25
微升，振蕩
15
秒，置
4
℃
13
小時或室溫
4
小時，每孔加
0.5%
的豚鼠紅細胞懸液
25
微升，振蕩
30
秒，置室溫
1
小時判定結(jié)果。以完全抑制的最高稀釋倍數(shù)做為
HI
價。同時設(shè)已知陽性血清、已知陰性血清、不加抗原的被檢血清及抗原、紅細胞對照?？乖瓕φ找嗉吹诙味?，復(fù)核使用單位。
（二）
判定標準及注意事項
1．
判定時先檢查對照是否正確，唯有對照各孔準確方可證明操作和使用材料無誤。
2．
紅細胞凝集現(xiàn)象的判定
（
1
）紅細胞均勻的平均鋪于孔底者可判為“
++++”
。
（
2
）基本上與（
1
）相同，但邊緣有下滑皺縮者為“
+++
”。
（
3
）紅細胞于孔底形成環(huán)狀或成團，四周有小凝集塊者為“
++
”。
（
4
）紅細胞于孔底形成團塊，但邊緣不整齊或有少量小塊者為“
+
”。
（
5
）紅細胞于孔底形成小團塊，邊緣整齊光滑，稀釋液清亮者為“—”。
“
++
”以上凝集的最高稀釋倍數(shù)做為
HA
價。
3
．凝集抑制：
本試驗紅細胞集中于孔底呈團塊狀，邊緣光滑整齊為陽性，以“—”表示，說明抗原凝集紅細胞的特性已被抑制，反之紅細胞呈“
++
”以上凝集現(xiàn)象者判為陰性。
1．
凝集抑制價
：以被檢血清最大稀釋倍數(shù)能抑制紅細胞凝集者為該血清抑制價。
(
吳
斌)
豬細小病毒病乳膠凝集試驗（LAT）操作方法
豬細小病毒乳膠凝集試驗是用豬細小病毒培養(yǎng)液致敏乳膠抗原來檢測動物血清中的抗體。其具有簡便、快速、特異、敏感之優(yōu)點。
（一）
試驗材料
豬細小病毒病乳膠凝集試驗抗體檢測試劑盒：包括豬細小病毒致敏乳膠抗原、陽性血清、陰性血清和稀釋液、玻片、吸頭及使用說明書。由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院研制。
（二）
操作方法
1
．定性試驗：取檢測樣品（血清）、陽性血清、陰性血清、稀釋液各一滴，分置于玻片上，各加乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動1
~
2
分鐘，于3
~
5
分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。
2
．定量試驗：先將血清作連續(xù)稀釋，各取1滴依次滴加于乳膠凝集反應(yīng)板上，另設(shè)對照同上，隨后再各加乳膠抗原一滴，如上攪拌并搖動，判定。
（三）結(jié)果判定
1
．判定標準：
“++++”
全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明；
“+++”
大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；
“++”
約
50
％乳膠凝集，但顆粒較細，液體較混濁；
“+”
有少許凝集，液體呈混濁：
“
—
”
液滴呈原有的均勻乳狀。
2
．對照試驗出現(xiàn)如下結(jié)果試驗方可成立，否則應(yīng)重試：陽性血清加抗原呈“
++++”
；陰性血清加抗原呈“—
”
；抗原加稀釋液呈“—
”
。
以出現(xiàn)“
++”
以上凝集者判為陽性凝集。
（四）注意事項
1
．試劑在
2
~
8
℃
冷暗處保存，暫定
1
年。
2
．
乳膠抗原在
使用前應(yīng)輕輕搖勻。
(
吳
斌)
聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）檢測豬細小病毒
1
材料準備
:
待檢組織、組織勻漿器、蛋白酶
K
，十二烷基磺酸鈉（
SDS
），苯酚、氯仿，異戊醇（分析純）、
TEN
緩沖液。
引物：擴增豬細小病毒
VP2
基因中
445bp
基因片段，由上海生物工程公司合成。
序列為
,
上游引物
P1:
5’-CAGAATCAGCAACCTCAC-3’
下游引物
P2:
5’-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG-3’
儀器設(shè)備有：凝膠電泳紫外線檢測儀，
PCR
擴增儀，電泳儀
2
操作步驟：
2.1
樣品的采集：
采集病豬的淋巴結(jié)、肝臟置-20℃保存。
2.2
樣品處理
所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按
1:5
用
TEN
緩沖液懸浮收集于離心管內(nèi)，
-70
℃
反復(fù)凍融
3
次，
7000r/min
離心
5min
。取上清液
472.5
μ
l,
加入
25
μ
l 10
％
SDS
和
2.5
μ
l
的
20mg/ml
蛋白酶
K
，
50
℃
水浴搖床上放置
2h
后加入等量的飽和酚
500
μ
l
，渦旋
20s
。離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（
25:24:1
）抽提一次，再用氯仿：異戍醇（
24
：
1
）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入
20
μ
l
雙蒸水溶解，
-20
℃
貯存?zhèn)溆谩?/font>
2.3.
PCR
的操作程序
PCR
反應(yīng)體系為：總體積50μl，含有100μmol/L dNTPs，5μmol/L引物， 0.5U Taq酶及1μl模板DNA，常用的反應(yīng)體系組成如下：
10
×緩沖液
5.0 μl
25mM MgCl2
5.0
μl
dNTPs
1.0
μl
引物
各1.0μl
Taq
聚合酶
0.5μl
DNA
模板
1.0μl
滅菌去離子水
35.50μl
擴増條件為:94℃變性3分鐘，進入循環(huán)，94℃45秒，54℃45秒，72℃30秒，30個循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。
2.4
PCR
產(chǎn)物的檢測
PCR
擴增產(chǎn)物在
0.8
％的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，在紫外光下觀察結(jié)果，并與標準分子量比較，可見一條
445bp
的
DNA
片段。
作者:
hanhong
時間:
2009-6-24 22:13
沙發(fā)都被我坐了，資料也收藏了哈！
作者:
dwm8080
時間:
2009-6-24 22:13
基礎(chǔ)知識好，打包壓縮更方便
作者:
姜寧
時間:
2009-6-25 00:37
你可以操作嗎，到時找你檢測，如何？
歡迎光臨 畜牧人 (http://www.ffers.com.cn/)
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