大豆粉：將生大豆粉碎，過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)篩。在85 ℃和140 ℃下分別處理0、45、90、135和180min冷卻后裝入封口袋保存?zhèn)溆谩?/font>
1.2化學(xué)試劑
本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純(AR)，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。
1.3測(cè)定方法
1.3.1pH增值法
實(shí)驗(yàn)原理：將研細(xì)的試樣與尿素緩沖液混合，尿素在尿素酶作用下水解產(chǎn)生氨，使溶液pH 值改變，改變的程度與脲酶活性大小相關(guān)，因此可以用其與空白溶液的差值表示脲酶活性高低， 單位為△pH 值。
1.3.1.1主要溶液配制（1）磷酸緩沖液：將3.403 g磷酸氫二鉀加入100 ml水中溶解；將4.335 g磷酸氫二鉀溶于100 ml水中；將兩種溶液混合，稀釋至1000 ml。用弱酸或弱堿調(diào)至pH =7.0。
（2）尿素緩沖液：將15 g尿素加入500 ml上述磷酸緩沖液中。用弱酸或弱堿調(diào)至pH =7.0。
1.3.1.2操作方法取0.200 g試樣，裝入比色管中。加入10 ml尿素緩沖液，迅速蓋上蓋子，劇烈搖動(dòng)。將比色管置于30±0.5 ℃的恒溫水浴鍋中，準(zhǔn)確保持30 min。
另稱取等量試樣放入另一支比色管中，加入10 ml磷酸緩沖液，蓋上蓋子，將試樣與緩沖液混合均勻，置于水浴鍋中保持30 min，作為空白試驗(yàn)。
每隔5 min將水浴鍋中比色管中的試樣搖勻一次。
每個(gè)比色管保持30 min后，從水浴鍋中取出，倒出上清液于小燒杯中。并在從水浴鍋中取出恰好5 min時(shí)，用酸度計(jì)測(cè)出pH值。
1.3.1.3
計(jì)算公式UA= pH 1－pH 0
式中：UA——脲酶活性，△pH；
pH 1——樣品使尿素分解后的樣液pH值；
pH 0——空白樣液的pH值.
1.3.2滴定法 原理：樣品與中性尿素緩沖液混合，在( 30±0.5) ℃下保持30 min, 樣品中脲酶催化尿素水解產(chǎn)生氨，用過(guò)量的鹽酸中和氨，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴到溶液pH 值為4.70。脲酶活性用每克樣品在30±0.5 ℃下每分鐘產(chǎn)生氨態(tài)氮的毫克數(shù)表示，單位為NH3 mg/ g·min。
1.3.2.1
溶液配制（1）尿素緩沖液：將8.95 g磷酸氫二鈉和3.40 g磷酸二氫鈉溶于水中，并稀釋至1000 ml，再將30 g尿素溶于此磷酸緩沖液中。
（2）0.1 mol/L鹽酸溶液：8.3 ml鹽酸注入1000 ml水中。
（3）0.1 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4 g氫氧化鈉溶于水中，并稀釋至1000 ml。
1.3.2.2
操作方法（1）氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定
稱取0.6 g于105~110 ℃烘至恒重的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀，準(zhǔn)確至0.0001 g，溶于50 ml水中，加2滴酚酞指示劑，用配制好的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈粉紅色。
同時(shí)做空白試驗(yàn)。
（2）UA的測(cè)定
稱取0.2000 g試樣，轉(zhuǎn)入比色管中，加入10 ml尿素緩沖液，立即蓋好蓋子并劇烈搖動(dòng)。置于30±0.5℃恒溫水浴上準(zhǔn)確保持30 min后立即加入10 ml 0.1 mol/L鹽酸，迅速冷卻到20℃，將比色管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)入燒杯，用水沖洗比色管2~3次，立即用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至pH＝4.7。
另取比色管做空白試驗(yàn)，加入10 ml尿素緩沖液，10 ml 0.1 mol/L鹽酸。稱取與上述試樣量相當(dāng)?shù)脑嚇樱杆偌尤氡壬苤?，立即蓋好比色管并劇烈搖動(dòng)，在30±0.5℃恒溫水浴上準(zhǔn)確保持30 min，冷卻到20℃，將比色管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)入燒杯，用水沖洗比色管2~3次，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至pH＝4.7。
1.3.2.3
計(jì)算公式 U=14×c(V0 - V)/30×m
式中: U—— —每分鐘每克大豆制品釋放氮的毫克量表示的脲酶活性；
c —— —?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度(mol/l) ；
V0 —— —空白試驗(yàn)消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液體積(ml)；
V—— —測(cè)定試樣消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液體積(ml) ；
m—— —試樣質(zhì)量( g).
1.3.3蛋白質(zhì)溶解度的測(cè)定 原理：氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度可以反映大豆粕產(chǎn)品加熱過(guò)度的情況，不同加熱程度的大豆粕，氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度不同。先測(cè)定大豆粕樣品在規(guī)定的條件下，可溶于氫氧化鉀溶液中的粗蛋白質(zhì)含量，再測(cè)定同一大豆粕樣品中總的粗蛋白質(zhì)含量，計(jì)算出氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度[9-11]。
1.3.3.1
操作方法稱取樣品1.5 g，置于250 ml燒杯中，用移液管移取75 ml
氫氧化鉀溶液，用磁力攪拌器攪拌20 min，再將攪拌好的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以2700 r·pm
離心10 min，用移液管移取濾液15 ml,放入消化管中，用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量。
另稱取0.3 g樣品，按照凱氏半微量定氮法測(cè)定原料樣品中的粗蛋白含量。
1.3.3.2
計(jì)算公式蛋白質(zhì)溶解度＝15 ml上清液中粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)/ 0.3 g試樣中粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)
2結(jié)果與分析
2.1 85℃下不同加工時(shí)間段大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度85℃下大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度結(jié)果見(jiàn)表1。由表可見(jiàn)， 85℃加熱0-180min的條件下，大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度變化不明顯。結(jié)果表明85℃下熱處理對(duì)大豆蛋白破壞作用不明顯，該溫度大豆粉中的蛋白酶抑制劑的活性不足以破壞。滴定法和增值法測(cè)得的脲酶活性大小，在數(shù)值上差異較小。
表1
85℃下大豆粉脈酶活性及蛋白質(zhì)溶解度
Tab.1 The result of urease activit and protein solubility of soybean meal under 85℃
加熱時(shí)間
min
| 脲酶活性
| 蛋白質(zhì)溶解度（%）
|
pH增值法UA（△pH）
| 滴定法UA (NH3 mg/g·min)
|
0
| 2.30
| 2.47
| 82.11
|
45
| 2.22
| 2.43
| 81.05
|
90
| 2.16
| 2.40
| 80.07
|
135
| 2.08
| 2.38
| 76.84
|
180
| 2.00
| 2.35
| 75.03
|
2.2 140℃下不同加工時(shí)間段大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度 由表可見(jiàn)， 140℃加熱條件下，大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)降低，135min時(shí)，pH增值法測(cè)定的脲酶活性為0；蛋白質(zhì)溶解度從82.1%降至22.5%。表明140℃熱處理對(duì)大豆蛋白和脲酶活性破壞明顯，說(shuō)明140℃熱處理可以破壞大豆粉中蛋白酶抑制劑活性，但對(duì)蛋白質(zhì)品質(zhì)也有不良影響。兩種方法測(cè)得的脈酶活性大小，與85℃熱處理一樣，在數(shù)值上滴定法稍大， 但與增值法無(wú)明顯區(qū)別。
表2. 140℃下大豆粉脈酶活性及蛋白質(zhì)溶解度
Tab.2 The result of urease activit and protein solubility of soybean meal under 140℃
加熱時(shí)間
min
| 脲酶活性
| 蛋白質(zhì)溶解度（%）
|
pH增值法UA（△pH）
| 滴定法UA (NH3 mg/g·min)
|
0
| 2.30
| 2.47
| 82.1
|
45
| 0.15
| 0.20
| 72.5
|
90
| 0.04
| 0.05
| 53.8
|
135
| 0.00
| 0.02
| 33.7
|
180
| 0.00
| 0.00
| 24.3
|
3討論
3.1兩種方法對(duì)脲酶活性測(cè)定結(jié)果的比較從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然不同方法測(cè)定同一樣品的結(jié)果在數(shù)值上不完全等，但兩種方法所測(cè)得脲酶活性的強(qiáng)弱趨勢(shì)相一致。根據(jù)國(guó)家在制定大豆餅粕脲酶活性的測(cè)定方法(滴定法)時(shí)，并規(guī)定了大豆餅粕脲酶活性用此方法測(cè)得的數(shù)值不應(yīng)大于0.4 NH3mg/g·min[7，12]。從表1和表2結(jié)果可見(jiàn)，在85℃條件下，作用0~180 min內(nèi)，大豆粉的脲酶活性均未能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，在該條件下產(chǎn)品所含胰蛋白酶抑制因子的被破壞程度較低，并對(duì)大豆粉蛋白的質(zhì)量影響不大。相對(duì)而言，在140℃下，作用0~180min內(nèi)，大豆粉的脲酶活性已大大降低，均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，尤其是當(dāng)作用時(shí)間超過(guò)135 min后，兩種方法測(cè)定的結(jié)果顯示被測(cè)樣品中脲酶活性為0。
3.2脲酶活性與蛋白質(zhì)溶解度的關(guān)系除了脲酶活性外，蛋白質(zhì)溶解度是近年來(lái)判定大豆制品質(zhì)量的常用指標(biāo)。由于脲酶活性高低反映大豆餅粕受熱程度，可間接反映蛋白酶抑制因子活性高低，但當(dāng)脲酶活性為0后，進(jìn)一步加熱，脲酶活性仍為0，即此時(shí)脲酶活性不再能反映大豆餅粕的受熱程度，而蛋白質(zhì)溶解度仍可隨受熱程度的增加進(jìn)一步降低[13]，因此，脲酶活性主要用于評(píng)價(jià)大豆制品是否過(guò)生，在反映大豆及其制品的加工是否受熱過(guò)度方面，用蛋白質(zhì)溶解度來(lái)評(píng)判更為適宜[7]。
20世紀(jì)60年代末，Rinehart首先采用0.2%氫氧化鉀測(cè)蛋白質(zhì)溶解度的方法來(lái)評(píng)定大豆粕加工的適宜程度，由于該方法簡(jiǎn)單、易學(xué)，重復(fù)性和再現(xiàn)性好，被世界各國(guó)廣泛采用[14]。Araba和Dale研究結(jié)果表明，當(dāng)大豆粕的蛋白質(zhì)溶解度低于70%時(shí)，很可能影響其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶解度低于65%時(shí)，則肯定大豆粕已加熱過(guò)度[15-16]。近年來(lái)，隨著加工技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，完全可以生產(chǎn)出蛋白質(zhì)溶解度超過(guò)85%甚至達(dá)到90%，而脲酶活性接近于零的優(yōu)質(zhì)大豆產(chǎn)品[11]。
從表1和2結(jié)果顯示，大豆粉的蛋白質(zhì)溶解度隨著加工溫度的提高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。在140℃下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆粉蛋白質(zhì)溶解度降低更加顯著。同時(shí)，兩種方法的測(cè)定結(jié)果在數(shù)值上不能相互替代，由此可見(jiàn)，在對(duì)大豆餅粕脲酶活性進(jìn)行表述或提出具體限量要求時(shí)，應(yīng)明確測(cè)定方法，避免引起不必要的糾紛。對(duì)于鑒定豆粕質(zhì)量時(shí)，脲酶活性只能判定其內(nèi)非營(yíng)養(yǎng)成分的鈍化程度，而對(duì)過(guò)度加熱的豆粕蛋白變性程度卻無(wú)法測(cè)定，故建議用脲酶活性與蛋白質(zhì)溶解度相結(jié)合的檢測(cè)手段進(jìn)行評(píng)價(jià)。
作者: xishanzhongke 時(shí)間: 2009-7-27 10:54
詳細(xì)樓主的資料，收藏了！
作者: weihua0608 時(shí)間: 2009-8-2 17:09
怎么沒(méi)看到苯酚紅這三個(gè)字呢?
作者: LXSLDXH0521 時(shí)間: 2009-8-2 22:40
我們沒(méi)有離心機(jī), 測(cè)不了氫氧化鉀溶解度
作者: zhenjieli 時(shí)間: 2012-6-1 12:01
看后不能光說(shuō)感謝就行了，分享我的的體會(huì)：
1、該方法測(cè)脲酶活性比較簡(jiǎn)單，大部分企業(yè)都能做的，而且相對(duì)較準(zhǔn)；
2、脲酶活性反映胰蛋白酶抗?fàn)I養(yǎng)因子的多少和大豆加工的生熟程度以及蛋白溶解度——主要是這三點(diǎn)。
3、一般加熱過(guò)度的豆粕脲酶活性會(huì)高，蛋白溶解度會(huì)低于65%。較好的豆粕、大豆溶解度胃80左右。
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