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標題: 豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的診斷及其分子特點 [打印本頁]
作者: fcltufh    時間: 2010-5-16 11:16
標題: 豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的診斷及其分子特點
豬繁殖與呼吸綜合征(poreine reproductive andrespiratorysyndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(poreine reprOductive and respiratoly syndromevirus，PRRSV)引起豬的一種繁殖和呼吸障礙的傳染病，是一種免疫抑制性疾病。以母豬妊娠后期的早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)弱胎、木乃伊胎，以及仔豬、架子豬肺炎及斷奶后死亡率升高為特點。PRRSV屬于動脈炎病毒科成員之一，基因組長度約為15 knt，含有8個開放閱讀框架(ORFs)，其中ORFla和ORnb約占基因組的80％，主要編碼病毒復制酶和聚合酶，與病毒的復制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)；ORFla所編碼的寡聚蛋白經(jīng)加工后成為6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSPld，NSPlp，NSP2-NSP5)，ORFlb被ORFla所編碼的蛋白酶切割可形成4個蛋白(RdRp，CP2，CP3，CP4)；ORF2-ORF7編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白GP2、GP3、GP4、GP5(E)、M和N蛋白，GP2—GP5為糖蛋白，M為膜基質(zhì)蛋白，N為核衣殼蛋白。目前根據(jù)基因型和抗原性的差異將PRRSV分為美洲型和歐洲型2種，各自代表株分別為VR-2332株和LV株，NSP2在兩型中差異大，推測NSP2的差異可能與病毒株的某種功能有關(guān)系。ORF5和NSP2可能代表全基因在遺傳學上的可變區(qū)，說明PRRSV的病原性非常多變。
    2006年在中國發(fā)生PRRS，由南向北波及16個以上省、市、自治區(qū)，造成巨大的經(jīng)濟損失。本實驗室對北京及其周邊地區(qū)的來自4個豬場的4頭病豬通過流行病學、病理學及病毒比較基因組學的系統(tǒng)研究，現(xiàn)報告如下。
1  材料與方法
1．1  病料與試劑
    病料：4頭病死豬(BJSY-1，BJPG，BJSD和BJBLZ)，分別來自于北京及其周邊地區(qū)4個豬場。
    細胞：Marc—145細胞由本實驗室保存。
    試劑：TrizollnvetrogenTM試劑；TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver．3．0試劑盒；TaKaRa Agarose GelDNAPurification KitVer．2．0；含10％新生牛血清的DMEM(GIBCO)的培養(yǎng)液，含2％新生牛血清的DMEM的維持液；氯仿；異丙醇；乙醇，二甲苯，10％中性福爾馬林，伊紅，蘇木素等。
1．2  引物
    根據(jù)GenBank中PRRSV美洲株VR-2332(DQl76021)等序列，遵循引物設(shè)計原則，利用PrimerPremier5．0，DNAMAN和DNAStar自行設(shè)計以下引物(表1)。由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
  
1．3  PRRSV參考毒株
    29株毒株及GenBank登錄號分別為：歐洲株有Lelystad  virus  (MYPOLYENV)，  Euro  PRRSV(AY366525)，  01CBl  (DQ864705)，  Sml—08(DQ489311)；美洲株有16244B(AF046869)，SP(AFl84212  )，  VR-2332  (  PRU87392  )，  BJ-4(A1331831  )，  CH-1a  (  AY032626  )，  P129(AF494042)，PA8(AFl76348)，HNl(AY457635)，JAl42  (AY424271)，  MLV  (AF066183)，  PL97-1(AY585241)，HB-1(sh)／2002(AYl50312)，HB-2(sh)／2002(AY262352)，MNl84A(DQl76019)，MNl84B(DQl76020)，VR-2332 V7(DQl76021)，LMY(DQ473474)，Prome Pac(DQ779791)，PRRSV(NC  —  001％1)，  HEBl  (EFll2447)，  JXAl(EFll2445)，WUHl(EUl87484)，S1(DQ459471)，SHH(EUl06888)，LN(EUl09502)。
1．4  PRRS的調(diào)查與檢查
    對PRRS流行病學及臨床癥狀進行調(diào)查。
    病理學檢查：按常規(guī)方法進行尸體剖檢，記錄眼觀病變，采取心臟、肺臟、脾臟、各部位淋巴結(jié)、腎臟、腎上腺、胰腺、扁桃體、甲狀腺、胃、各段腸道和腦組織。固定于10％的中性福爾馬林溶液中，常規(guī)石蠟包埋制片，H．E染色。光學顯微鏡下觀察。
    血清學檢查：將采集的豬全血，離心8 min，3 000r／min，分離血清。送中國農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心采用ELISA進行PRRSV抗體檢測。
1．5  PRRSV核酸檢測
    剖檢時無菌取肺臟、肝臟、淋巴結(jié)、脾臟以及腦等放于封口袋中，于-70℃?zhèn)溆谩?
    RNA的提?。簭?個豬場4具尸體肺臟或肝臟，脾臟，淋巴結(jié)中提取PRRSV RNA，按Trizol invitro-genTM試劑盒說明書操作。
    RT-PCR反應(yīng)：按TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver．3．0試劑盒說明書操作，檢測引物退火溫度為50 ℃。
1．6  病毒分離
1．6．1  病抖處理
    單獨取一種臟器或混合稱取肺臟、脾臟、肝臟和淋巴結(jié)，用研磨器研磨，按1：5比例加入PBS(pH7．2)制成勻漿，反復凍融3次，離心10 min，3 800r／min，上清液用0．22／xm微孔濾膜過濾后待接種Marc—145細胞。
1．6．2  病毒的增殖
    將處理好的病料接種形成單層的Marc-145細胞，1 mL／瓶，37℃吸附60min，棄去接種毒液，加入維持液5mL，37℃培養(yǎng)，連續(xù)培育觀察5d反復凍融3次，收獲培養(yǎng)上清液，繼續(xù)盲傳5代。當細胞出現(xiàn)CPE達70％—80％時收毒，分別命名為BJSY-1、BJPG、BJSD和BJBLZ株，-70 ℃保存。
1．7  PRRSV全基因序列測定
1．7．1  PRRSV RNA提取
    從收取的Marc-145細胞毒液中，按Trizolinvitro-senTM試劑盒說明書操作，提取PRRSVRNA。
1．7．2  RT-PCR反應(yīng)
    按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver．3．0試劑盒說明書操作，退火溫度48—58 ℃。
1．7．3  PCR產(chǎn)物純化和測序
    取60ulpcr產(chǎn)物點樣，110 V電泳，回收純化按照TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer．2．0試劑盒說明書操作，送北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司測序。
1．8  序列分析
    用Primer Premier 5．0，DNAMAN和DNAStar生物學軟件將PRRSV各段基因的測序結(jié)果拼接，進行序列比對和遺傳演化分析。
2  結(jié)果與分析
2．1  流行病學調(diào)查
    30-60kS的肥豬發(fā)病，病程5—15d，調(diào)查總體發(fā)病率達50％以上，病死率80％以上。4個豬場的具體數(shù)據(jù)分別為BJSD場49頭肥豬全部發(fā)病，其中16頭死亡，發(fā)病率100％，病死率33％；BJPG場400頭肥豬近200頭發(fā)病死亡，仍有不斷發(fā)??；BJSY-1場肥豬600多頭，發(fā)病后2 d內(nèi)死亡250頭，死亡率達到42％；BJBLZ場700頭肥豬，發(fā)病40頭，9頭死亡，發(fā)病率6％以上，病死率23％。
    10％母豬流產(chǎn)，死胎率25％，3％的經(jīng)產(chǎn)和初產(chǎn)母豬在產(chǎn)仔后死亡。約10％的公豬出現(xiàn)了咳嗽等呼吸道癥狀。
    仔豬10日齡開始發(fā)病，以斷奶后到50日齡的發(fā)病為多，病程15～20 d，仔豬總體情況為發(fā)病率70％以上，病死率90％以上。4個豬場仔豬的發(fā)病情況如下：BJSD場100頭仔豬幾乎全部死亡；BJPG場斷奶后的仔豬死亡率高達80％以上；母豬達600頭的BJSY-1場仔豬死亡率80％以上；BJBLZ場飼養(yǎng)800多頭母豬，經(jīng)產(chǎn)600多頭，仔豬死亡率30％-40％。
2．2  臨床癥狀調(diào)查
    病豬高熱，達41 ℃，厭食或不食，呼吸困難，扎堆，有的轉(zhuǎn)圈或抽搐，嘶叫，口吐白沫，臥地不起而死。
2．3  病理學檢查
2．3．1  眼觀病變
    發(fā)病豬或病死豬耳尖、頸部、腹部、臀部和尾部皮膚紫紅色。肺臟膨脹，表面凸凹不平，見出血點或出血斑，質(zhì)地較硬實；間質(zhì)增寬，兩側(cè)肺組織均見病變。心包膜增厚，心臟橫徑增寬，心肌質(zhì)地較軟；冠狀溝脂肪減少并呈黃色膠凍樣。肝臟質(zhì)地較脆，色澤不均一，肝小葉界限清晰。脾臟質(zhì)地較軟，表面不平，呈不同程度腫大，切面隆起且白髓減少。腎臟被膜易于剝離，被膜下有的散在出血點或出血斑，皮髓質(zhì)界限不清，有的皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎乳頭上均有明顯的出血點。淋巴結(jié)腫大，表面和切面灰紅色或暗紅色，切面不平整。扁桃體出血，腫脹，表面有灰白色病灶。胃腸漿膜面、黏膜面出血，黏膜面有的可見潰瘍灶。
2．3．2  病理組織學檢查
    肺臟：肺泡膈單核細胞和淋巴細胞等為主的炎性細胞浸潤和增生，肺泡膈明顯增厚，其中部分炎性細胞壞死崩解，肺泡壁被擠壓導致肺泡縮小(圖1)。有的肺泡壁上皮細胞活化，增生呈立方形；肺泡壁毛細血管擴張，充滿紅細胞，肺泡腔有紅細胞以及纖維素和漿液滲出。細支氣管黏膜上皮細胞增生并向管腔形成突起，有的上皮細胞脫落于管腔內(nèi)，甚至有的支氣管上皮細胞呈“套管樣”脫落。支氣管管壁及其外周均有炎性細胞浸潤，并見壞死的細胞產(chǎn)物、滲出的紅色絲網(wǎng)狀物質(zhì)。有的肺泡和支氣管區(qū)域?qū)嵶?，充滿炎性細胞，以巨噬細胞和淋巴細胞為主，還有中性粒細胞，以及這些細胞的壞死產(chǎn)物，紅細胞和滲出物。有的肺泡聯(lián)合呈肺氣腫表現(xiàn)。
    腦：小血管和毛細血管擴張充滿紅細胞，血管周圍聚集大量淋巴細胞，形成“管套”樣結(jié)構(gòu)(圖2)，并與周圍組織因水腫而有間隙。膠質(zhì)細胞增生，形成膠質(zhì)小結(jié)。有的小膠質(zhì)細胞圍繞在神經(jīng)細胞外周或進入其中而出現(xiàn)“衛(wèi)星”現(xiàn)象和“噬神經(jīng)元”現(xiàn)象(圖3)，部分神經(jīng)細胞出現(xiàn)固縮，甚至溶解、消失。脈絡(luò)叢血管擴張充滿紅細胞，周圍炎性細胞浸潤，有的發(fā)生壞死。
    脾臟：紅白髓混亂，脾小結(jié)不明顯，鞘動脈顯見，小梁輕微水腫。動脈周圍淋巴鞘內(nèi)淋巴細胞壞死，可見核破碎、核溶解和核消失，同時可見到較多的核分裂像(圖4)，同時可見“滿天星”現(xiàn)象。中央動脈內(nèi)皮細胞腫脹，發(fā)生透明變性。白髓炎性細胞浸潤，以巨噬細胞為主，還有嗜中性粒細胞和漿細胞。血管淤血，其間散布空泡樣物質(zhì)。
    淋巴結(jié)：皮質(zhì)、髓質(zhì)淋巴細胞均壞死，表現(xiàn)為核破碎、核溶解和核消失，同時可見“滿天星”現(xiàn)象(圖5)。淋巴竇內(nèi)可見大量巨噬細胞和漿細胞及少量的嗜中性粒細胞。小梁水腫，皮質(zhì)淋巴細胞和網(wǎng)狀細胞增生，難以分辯生發(fā)中心結(jié)構(gòu)。皮質(zhì)和髓質(zhì)均見充血，出血。
    腎臟：皮質(zhì)，髓質(zhì)均見血管內(nèi)充滿紅細胞。腎小管上皮細胞彌散性壞死，甚至管腔結(jié)構(gòu)也消失(圖6)；由于發(fā)生透明滴狀變，使管腔內(nèi)有紅色圓滴狀玻璃物質(zhì)，以及有一些脫落壞死的上皮細胞、炎性細胞和紅色或藍色絲網(wǎng)狀物質(zhì)；同時發(fā)生了脂肪變性、水泡變性和顆粒變性，其中有的圓形空泡內(nèi)有紅色致密樣或絲網(wǎng)狀物質(zhì)。腎小球大小不一，充滿紅細胞，球內(nèi)細胞壞死；球內(nèi)有散在的紫褐色顆粒；有的球內(nèi)結(jié)構(gòu)消失，使腎小球成空泡樣。間質(zhì)炎性細胞浸潤，以淋巴細胞和巨噬細胞為主，炎性細胞有的發(fā)生壞死。
  
    肝臟：肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)由于炎性細胞浸潤而增寬，以淋巴細胞和巨噬細胞為主，且有的炎性細胞壞死崩解。肝細胞腫脹、有大小不等圓形空泡樣物質(zhì)以及空泡樣物質(zhì)內(nèi)有絲網(wǎng)狀紅色物質(zhì)，為脂肪變性和水泡變性、或壞死，可見胞漿內(nèi)包涵體。肝血竇擴張充滿紅細胞，其間可見紫褐色顆粒。
    腸道：腸黏膜上皮細胞幾乎全部脫落，固有層炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，還有少量巨噬細胞、漿細胞和嗜酸性粒細胞，炎性細胞有的壞死崩解。固有層、黏膜下層、肌層水腫增厚，其內(nèi)毛細血管擴張，充滿紅細胞，血管周圍有炎性細胞浸潤。
    心臟：可見到血管周圍和間質(zhì)組織淋巴細胞和巨噬細胞等炎性細胞浸潤，有的巨噬細胞見吞紅現(xiàn)象。部分心肌細胞發(fā)生變性，甚至肌纖維壞死斷裂，其中有藍染鈣鹽顆粒沉著。
    扁桃體：扁桃體淋巴細胞增生，能分辨隱窩，淋巴小結(jié)，反應(yīng)中心等結(jié)構(gòu)，但不清晰。隱窩內(nèi)充滿炎性細胞，以淋巴細胞和巨噬細胞為主，且炎性細胞壞死。上皮細胞氣球樣變。
2．4  血清學檢查
    4份血清送農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心。采用ELISA進行PRRSV抗體檢測分別為0．870，0．603，1．270和1．001i結(jié)果顯示4份血清該抗體均強陽性(PRRSV抗體樣品檢驗結(jié)果≥0．276判為陽性，<0．276判為陰性)。
2．5  RT-PCR結(jié)果
    BJSY—1，BJPG，BJSD和BJBLZ病料RT-PCR擴增產(chǎn)物與預期大小一致。
2．6  病毒增殖
    病料接種Marc—145細胞，第一代不出現(xiàn)病變，盲傳2—3代后可出現(xiàn)細胞病變，第5代開始可引起規(guī)律性細胞病變(圖7)。一般在接毒后36—48 h即可見細胞變圓、聚集成團，48 h以后細胞開始崩解、脫落。
  
2．7  測序RT-PCR結(jié)果
    各片段均與預期大小一致(圖8)。
  
2．8  基因序列與遺傳演化分析
    BJSY-1、BJPG、BJSD和BJBLZ株的各片段連接后基因全長分別為15 319nt、15 317nt、15 344nt和15 316 nt，有8個開放閱讀框架，均在5，端有189個核苷酸的非編碼區(qū)，5’UTR有約7％的堿基發(fā)生變異，主要發(fā)生在中下游，同時近3，端的40個核苷酸序列高度保守，此外還有2個完全保守的CACCC基了七；ORFI在5，端，占全序列近80％，接著是6個編碼框(()RF2—7)，均從5，—3，端部分重疊；3’端分別有147、145、173和144個核苷酸的非編碼區(qū)。根據(jù)遺傳進化分析(圖9)，BJSY-l、BJPG、BJSD和BJBLZ株同2006年我國報道的JXAl為代表的高致病性PRRSV(1lp—PRRSV)毒株的距離最近，同我國報道的第l株剛-4以及美洲型代表株VR-2332在同一型內(nèi)，核苷酸同源性在83．3％—99．4％之間，而與歐洲性毒株核苷酸同源性只有58．3％左右，所以說此4株P(guān)RRSV均屬北美型；與我國分離的高毒力株HB-1為近親關(guān)系，核苷酸水平同源性均在96％以上。
    全基因顯示有6個結(jié)構(gòu)蛋白和13個非結(jié)構(gòu)蛋白，研究中意外發(fā)現(xiàn)獨特的NSP2，2個位置不連續(xù)缺失30個氨基酸，與美洲株比較1個保守的天冬氨酸(D)缺失，與歐洲株比較1個保守的絲氨酸(S)缺失，在核苷酸比對時是3個連續(xù)的T缺失，中間相隔53個氨基酸后連續(xù)缺失29個氨墓酸(圖10)。3，UTR后的Poly(A)尾巴在4株中長度不一致，BJSD最長，且末尾有27個連續(xù)的A，但是Poly(A)的上游是高度一致的結(jié)構(gòu)蛋白ORF2-7基本片段在核苷酸和氨基酸水平上與美洲株和歐洲株同源性比較結(jié)果見表2。
    ORF2編碼的氨基酸其間包含222個核苷酸(ORF2b)編碼73個氨基酸的蛋白，該蛋白49位和54位同所有的美洲株一樣，都是保守的半胱氨酸(Cys)。ORF3的83位氨基酸由谷氨酸(Glu)突變?yōu)楦拾彼?Gly)。ORF5的第二個糖基化位點發(fā)生變異，即33-35位的氨基酸相對VR-2332而言由NDS變?yōu)镹NN，同時也導致抗原相關(guān)區(qū)發(fā)生了變異；66位氨基酸S變?yōu)門，92位A變?yōu)镃，94位V變?yōu)锳，101—102位FV變?yōu)閅Y，121位T變?yōu)镮和127位F變?yōu)長，使ORF5的3個跨膜功能區(qū)均發(fā)生了突變；180—197位，即另一個抗原相關(guān)區(qū)氨基酸發(fā)生明顯的突變，甚至于所測的4株也不完全一致。ORF6的3個跨膜區(qū)位于17-88位氨基酸，其間只有70位K變?yōu)镽。N蛋白的第23，90位Cys沒有發(fā)生突變，第46位K變?yōu)镽；N端以精氨酸(Arg)，賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)為主。
  
3  討論
    對豬場的流行病學調(diào)查表明，本次疾病的發(fā)病率高、死亡率高、發(fā)病范圍廣、病程短；臨床癥狀以高熱、呼吸道癥狀、流產(chǎn)等為主，疫情出現(xiàn)豬急性高熱性傳染病特征；病理學檢查表明，主要病變?yōu)橹w末梢發(fā)紫，多器官出血，間質(zhì)性肺炎，非化濃性腦炎，變質(zhì)性肝炎，壞死性脾炎，壞死性淋巴結(jié)炎，間質(zhì)性腎炎，上述病變同文獻報道L6-9j的PRRS病變基本一致；應(yīng)用RT-PCR針對PRRSV特異性片段進行擴增，果為陽性，用Marc-145細胞進行病毒分離培養(yǎng)，出現(xiàn)明顯細胞病變，對分離株用RT-PCR方法提取病毒核酸，擴增設(shè)計好的包括全長的各個片段，膠回收純化后測序分析所分離的4株P(guān)RRSV均屬于北美洲型。
    文獻報道，結(jié)構(gòu)蛋白中，ORF6最保守，ORF5和ORF3最易發(fā)生變異。有研究表明，ORF3的83位氨基酸與毒力有關(guān)，所測的4株該氨基酸均由Glu突變?yōu)镚ly，該位的突變是否引起了毒力增強值得進一步研究。具有決定感染性的ORF7的第23、90位Cys未發(fā)生突變；第46位K變?yōu)镽；是否改變其核定位信號的功能需進一步研究。特別是NSP2存在30個氨基酸的不連續(xù)缺失，這一特點顯示為我國2006年高致病性PRRSV毒株所特有的，意味著它可能是異常致病力標志區(qū)域，或是此區(qū)域的缺失與病毒空間構(gòu)象相關(guān)，從而導致毒株毒力增強。同時提示該區(qū)域是PRRSV毒株從分離第1株到今天的高致病性毒株演變的一個標志性區(qū)域，因為2002年報道的中國分離強毒HB-2株在此次缺失3個T的區(qū)域存在不同的缺失，以及2006年報道的美國分離株MNl84A、B和C株在這次缺失3個T的區(qū)域間隔一個核苷酸后有連續(xù)的3個核苷酸缺失，在這次缺失29個氨基酸的部位也有不連續(xù)的57個核苷酸缺失；且該區(qū)域也是美洲株和歐洲株差異顯著的區(qū)域。另外其他部位的突變或缺失也有可能改變其毒力，導致此次PRRS呈非典型性，正如一些報道此次毒力的變化是多個突變位點累積效應(yīng)所致。
作者: sxx123    時間: 2010-5-16 16:51
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[ts]sxx123 于 2010-5-16 16:51 補充以下內(nèi)容[/ts]

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[ts]sxx123 于 2010-5-16 16:52 補充以下內(nèi)容[/ts]

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