雞壞死性腸炎的致病機理及益生菌干預

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摘要：雞壞死性腸炎是一種家禽高發(fā)性腸道疾病, 給家禽生產者帶來巨大經濟損失, 其主要由產氣莢膜梭菌感染所致。益生菌可通過提高宿主機體的腸道屏障、免疫功能和抑制腸上皮細胞凋亡等方式防御雞壞死性腸炎。本文就雞壞死性腸炎的致病機理及益生菌對其的干預研究進展進行綜述, 為雞壞死性腸炎的科學防治提供參考。

關鍵詞：雞、壞死性腸炎、產氣莢膜梭菌、益生菌  

雞壞死性腸炎(necrotic enteritis)是家禽常見的腸道疾病，每年給全球家禽業(yè)帶來約60億美元的經濟損失[1]。雖然急性雞壞死性腸炎死亡率高達50%，生產中更多的是以亞臨床雞壞死性腸炎(subclinical necrotic enteritis，SNE)的形式存在，其嚴重影響家禽的生長性能和飼料轉化效率。飼糧添加抗生素是防治雞壞死性腸炎的有效措施，但隨著我國全面禁止抗生素作為促生長類飼料添加劑的使用，雞壞死性腸炎的防治面臨巨大挑戰(zhàn)。2001年，益生菌被定義為“通過攝取適當?shù)牧繒r對宿主身體健康能發(fā)揮有效作用的活菌”[2]。益生菌及其代謝產物尤其是短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)、次級膽汁酸(secondary bile acids，SBA)和色氨酸(Trp)等，具有維持腸道上皮物理屏障、穩(wěn)定腸道微生物區(qū)系、調節(jié)宿主免疫功能、促進胃腸蠕動和抑制有害菌在腸上皮黏附侵襲等功能[3]。本文主要綜述了雞壞死性腸炎致病的重要毒力因子及益生菌對其干預方面的最新研究進展，為通過益生菌防治雞壞死性腸炎提供參考。

1、雞壞死性腸炎及其致病機理

1.1 雞壞死性腸炎的誘發(fā)因素及癥狀

雞壞死性腸炎主要是由產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)感染引起的腸道組織壞死性疾病。單一的產氣莢膜梭菌感染并非是導致壞死性腸炎的必然結果，還需其他誘發(fā)因素的共同作用，如高密度飼養(yǎng)帶來的應激、含魚粉的高蛋白質飲食等，均會導致雞壞死性腸炎[4]。
產氣莢膜梭菌定植的主要場所為小腸部位[5]。雞壞死性腸炎病變主要表現(xiàn)為：
1)組織層面。小腸大部分融合性黏膜壞死，腸內覆蓋有黃褐色或膽汁染色的假膜，典型的特征有黏膜表面凹陷潰瘍，壞死組織和活組織間界限清晰[5-6]。
2)細胞水平。腸道血管內皮細胞成孔死亡，壞死處嗜異性粒細胞聚集，大量的免疫細胞浸潤到固有層[7]。
3)分子水平。胞間緊密連接分子被破壞[8]，胞內促炎因子表達水平顯著提高，并誘導壞死因子的高表達[9]。

1.2 雞壞死性腸炎的致病機理

1.2.1 分泌毒素

產氣莢膜梭菌是革蘭氏陽性、厭氧菌，且革蘭氏陽性菌的細胞壁主要成分為肽聚糖(peptidoglycan)。肽聚糖可作為病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)被腸上皮細胞模式識別受體(pattern recognition receptors)，包括核苷酸寡聚化結構域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)樣受體或Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)所識別，進而激活核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路所介導的炎癥反應[10-11]。產氣莢膜梭菌可分泌20多種毒素[6]，引起疾病相關的毒素主要包括α(CPA，編碼基因plc或cpa)、β(CPB)、ε(編碼基因etx)、ι(編碼基因iap和ibp)、CPE(編碼基因cpe)和NetB(編碼基因netB)毒素[12]。根據(jù)毒素的類型，產氣莢膜梭菌被分為A~G型[13]。編碼α毒素的plc基因存在于細菌染色體的穩(wěn)定區(qū)域，可在所有產氣莢膜梭菌菌株中表達[12]；β毒素會引起腸毒血癥并可在細胞膜上成孔。最新研究發(fā)現(xiàn)，CD31是內皮細胞上特異性結合CPB的膜受體，膜外近端的的結構域免疫球蛋白6(Ig6)足以引起結合β毒素后產生的細胞損傷[14]，這可能是β毒素引起雞腸道黏膜出血的重要原因。由F型產氣莢膜梭菌分離出的CPE(與CPB毒素結構類似)，是分子量為35 kDa的多肽單體，其C末端結構域(cCPE)結合集序和閉合蛋白(claudins，CLDNs)家族結合形成寡聚體，并將CLDNs分解，而且CLDNs中NPLVA153基序(該基序穿透cCPE-β鏈之間的凹槽)的第3位亮氨酸能顯著提高其結合親和力[8, 15]。NetB毒素是由G型產氣莢膜梭菌分泌的一種成孔毒素(與β毒素功能類似)，鳥類紅細胞對其具有高度敏感性[16]，能夠在敏感細胞膜上形成內徑為26 Å的七聚體孔[17]，并且該孔對陽離子有強烈的偏好性。另外，對腸道基底膜(basement membranes)的破壞涉及到產氣莢膜梭菌分泌的一種微生物膠原酶(由colA基因編碼)，該酶能夠分解膠原蛋白質破壞基底膜的完整性并加重腸上皮組織的壞死[6]。

1.2.2 黏附定植

細菌的黏附定植與其自身的菌毛或鞭毛結構以及分泌的黏附素密切相關，能防止物理性的移位，這也是絕大多數(shù)細菌致病前提。產氣莢膜梭菌與許多革蘭氏陽性菌不同，其缺乏運動型鞭毛但具有與獨立鞭毛不同的Ⅳ型菌毛(T4P)的滑行功能，且Ⅳ型菌毛系統(tǒng)有多種生物功能，如細菌生物膜的形成和黏附[18]，這可能是其具有黏附定植能力的主要原因。產氣莢膜梭菌中高度保守的VR-10B基因座編碼7個基因，大部分被預測為黏附菌毛樣蛋白[19]，其中黏附素編碼基因cnaA缺失突變體無法誘導肉雞壞死性腸炎的發(fā)生，且對Ⅳ型膠原蛋白的黏附及破壞能力顯著下降[20]，這表明cnaA基因是決定產氣莢膜梭菌黏附定植的關鍵基因；Ⅳ型膠原蛋白是腸基底膜的主要成分，基底膜在組織結構和功能維護中發(fā)揮重要作用[21]。

研究表明，強毒性產氣莢膜梭菌菌株失去編碼帶有netB的NELoc-1基因座，其毒力顯著下降，單獨引入netB基因后對體外細胞的毒性可恢復至野生型，但攻擊雞后卻沒有完全恢復毒力作用，因為NELoc-1上仍然編碼著預測的毒力因子，比如黏附素[22]。這些研究提示，產氣莢膜梭菌需要在宿主上黏附定植后才具有完整的毒力作用，可能潛在介導產氣莢膜梭菌黏附定植后刺激宿主并造成損傷的途徑，但具體機制有待解析。

1.2.3 群體感應(quorum sensing，QS)系統(tǒng)

QS系統(tǒng)是細菌之間通過信號肽(signaling peptide)分子來實現(xiàn)交流的重要方式，不同細菌種間和種內能夠通過QS系統(tǒng)調節(jié)彼此的生長及基因表達[23]。近年來的研究表明，輔助基因調節(jié)(accessory gene regulator，AGR)系統(tǒng)是產氣莢膜梭菌最主要的QS調節(jié)系統(tǒng)，對其毒素分泌和調節(jié)發(fā)揮關鍵作用[24-25]，這也可能是益生菌通過QS系統(tǒng)抑制產氣莢膜梭菌分泌毒素的重要途徑之一。AGR系統(tǒng)是QS系統(tǒng)的一種，由4個共轉錄基因(agrA、agrB、agrC和agrD)組成，agrD編碼的自誘導肽(autoinducing peptide)前體被agrB轉運蛋白加工成活性自誘導肽后分泌到環(huán)境中，然后被VirS/VirR(VirS/R)雙組分調節(jié)系統(tǒng)(two-component regulatory systems，TCRS)識別并且調節(jié)毒素[α、β、NetB和PFO(θ)等]的基因表達[26-27]。最新研究證實，VirS膜受體蛋白主要是細胞外環(huán)與信號肽進行識別結合[28]。值得一提的是，屬于QS系統(tǒng)的2型自誘導信號分子(autoinducer-2)在革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有表達[23, 29]，2型自誘導信號分子是否能夠被AGR系統(tǒng)識別尚不清楚，也可能是益生菌抑制產氣莢膜梭菌分泌毒素或降解酶表達的潛在生物因子。

1.2.4 誘導腸上皮細胞壞死性凋亡

腸上皮細胞壞死是雞壞死性腸炎標志特征，且上皮細胞程序性壞死與受體互相作用蛋白激酶1/3(receptor interacting protein kinase 1/3，RIPK1/3)結合形成的壞死復合體有關。Shrestha等[9]研究表明，特異性RIPK1/3抑制劑能夠減少CPE毒素誘導的混合譜系激酶結構域樣假激酶(MLKL)的寡聚化和Caco-2細胞凋亡，說明RIPK1、RIPK3和MLKL是促進CPE誘導細胞壞死性凋亡的重要信號分子。然而，CPE誘導的細胞死亡途徑在不同類型細胞間存在差異。另一項研究發(fā)現(xiàn)，Parkin蛋白質(由PARK2基因編碼的一種蛋白質)通過抑制RIPK3的磷酸化和RIPK1/3復合體的形成來負調控細胞壞死性凋亡而非自噬，且Parkin蛋白質的E3泛素連接酶活性是抑制細胞壞死所必要的，這種調節(jié)可能是誘導腸上皮組織壞死和炎癥的重要機制[30]。

2、益生菌對壞死性腸炎的干預效果及機理

2.1 維持腸道結構和功能完整性

腸絨毛高度/隱窩深度(V/C)值是衡量腸道消化吸收功能的重要指標。Shanmugasundaram等[31]研究指出，通過給感染壞死性腸炎的雞口服復合益生菌(羅伊乳酸桿菌、糞腸球菌、動物雙歧桿菌和乳酸片球菌)的共培養(yǎng)上清液，逆轉了V/C值的降低，改善了腸道結構的完整性。這可能與復合益生菌中的乳酸菌能夠產酸有關，因為當pH低于5.1時，對酸度敏感的產氣莢膜梭菌增殖能力大幅下降[32]。腸道上皮細胞間的緊密連接(tight junction)是腸道機械屏障主要的物理防御，其中閉鎖蛋白(occludin，OCLN)和CLDNs是緊密連接的2類關鍵蛋白，能夠維持腸上皮結構的完整性，防止外界有害因子跨過腸道屏障進入黏膜層甚至基底膜，進而對腸道組織造成嚴重損傷[33]。脂多糖(LPS)處理人腦微血管內皮細胞(hCMEC/D3)后OCLN的表達顯著下調，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases，p38 MAPK)的磷酸化顯著增加[34]，這可能是機體對屏障損傷的代償機制。微生物的代謝產物SCFAs具有提高組織緊密連接蛋白表達、維持腸道甚至大腦屏障的功能[35-36]。Gharib-Naseri等[37]研究表明，雞患壞死性腸炎時補充解淀粉芽孢桿菌CECT 5940可顯著上調CLDN-2和OCLN蛋白的表達，丁酸梭菌可通過劑量依賴方式上調宿主腸道CLDN-1和CLDN-2的mRNA豐度[38]，可能是其代謝產物丁酸鹽通過促進腸道緊密連接蛋白的表達所致(圖 1)[27, 38-39]。

2.2 提高腸道抗氧化能力

腸黏膜的抗氧化能力對腸道健康至關重要，而抗氧化能力的降低是壞死性腸炎對宿主腸道損傷、降低生產性能的重要途徑。Zhao等[40]研究表明，飼糧添加地衣芽孢桿菌H2可顯著提高患壞死性腸炎雞回腸的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和總抗氧化能力(T-AOC)，表明地衣芽孢桿菌H2能夠有效增強腸道組織的抗氧化能力，緩解壞死性腸炎引起的腸道氧化損傷。Wang等[39]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加約氏乳桿菌BS15可顯著提高壞死性腸炎雞小腸過氧化氫酶(CAT)、SOD和GSH-Px的活性以及降低丙二醛(MDA)的含量，提高抗氧化能力。Eeckhaut等[41]研究表明，飼糧添加一種可以高效產生丁酸鹽的益生菌，可有效降低因壞死性腸炎導致的死亡雞的數(shù)量。上述結果表明，益生菌能夠提高感染壞死性腸炎動物腸道的抗氧化能力，減少腸道氧化損傷程度，降低動物的死亡率。

2.3 改善腸道微生物區(qū)系平衡

腸道菌群的失衡易導致疾病的發(fā)生，感染壞死性腸炎的腸道中有益菌及菌群結構的豐度均受到不同程度的改變。感染壞死性腸炎后保守的腸道菌群改變表現(xiàn)為：梭菌科的減少和乳桿菌科及其他種類的相對增加，菌群結構變化或許可作為評價雞壞死性腸炎的重要指標之一。研究顯示，梭菌科如未分類的梭狀芽胞桿菌科、念珠菌節(jié)桿菌、未分類的SMB53和未分類的消化鏈球菌和鏈球菌豐度均顯著降低，這些都是產氣莢膜梭菌感染前腸道中高度豐富的原生菌群，且原生的梭狀芽孢桿菌由感染前胃腸道占比的40%下降到10%[42]，土著細菌豐度的降低表明產氣莢膜梭菌在宿主腸道中奪取生態(tài)位以及營養(yǎng)物所致的競爭性抑制。產氣莢膜梭菌會抑制有益菌的增殖，患有壞死性腸炎雞的盲腸中魏氏乳酸菌和布氏瘤胃球菌的數(shù)量均顯著下降[43]。魏氏乳酸菌VP30是一種高產胞外多糖(EPS)的有益菌[44]，EPS是益生菌產生的功能(抗炎、抗氧化和抗腫瘤)物質；布氏瘤胃球菌是高效的抗性淀粉降解菌[45]，同樣是人腸結腸中關鍵的抗性淀粉的關鍵物種[46]，而抗性淀粉和纖維有利于腸道重要的微生物代謝產物SCFAs的產生，因此補充具有分泌EPS或強分解抗性淀粉功能的益生菌可能有助于預防或緩解壞死性腸炎對腸道微生物區(qū)系平衡的破壞。

益生菌的補充能抑制宿主腸道中產氣莢膜梭菌的增殖，促進有益菌的繁殖，進而改善腸道微生物區(qū)系。感染壞死性腸炎后添加丁酸梭菌，能夠增加泰國外絲菌、臨時未分類外絲菌和乳酸片球菌等有益菌的豐度[38]。植物乳桿菌和多黏類芽孢桿菌能夠恢復壞死性腸炎導致的腸道菌群失調，增加枯草桿菌、乳球菌、假黃桿菌和口腔桿菌等有益菌的豐度[47]。給患有壞死性腸炎雞飼糧補充凝結芽孢桿菌，其盲腸內容物中大腸桿菌和產氣莢膜梭菌的數(shù)量顯著下降，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著上升，說明凝結芽孢桿菌有利于增強有益菌的生態(tài)位，維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)[48]。

上述研究表明，腸道穩(wěn)態(tài)可保證宿主機體營養(yǎng)物質的穩(wěn)定供應，壞死性腸炎會破壞腸道穩(wěn)態(tài)并導致營養(yǎng)物質吸收失衡，而益生菌的外源補充能修復腸道穩(wěn)態(tài)，增強腸道對壞死性腸炎的抵抗能力。

2.4 增強宿主腸道免疫功能

雞壞死性腸炎導致宿主腸道炎癥反應增強，益生菌可通過抑制促炎因子、促進抗炎因子的表達水平，進而提高腸道免疫功能，緩解壞死性腸炎誘導的腸道損傷。白細胞介素-17(IL-17)是一種由輔助性T淋巴細胞17(Th17)分泌產生的促炎因子，p38 MAPK介導Th17細胞在誘導組織炎癥中具有特異性調控作用[49]。Gong等[50]研究表明，枯草芽孢桿菌可下調腸道IL-17的表達，緩解因葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠炎癥性腸炎。相反，白細胞介素-10(IL-10)是一種重要的抗炎因子，幾乎由所有的白細胞亞群產生，包括樹突狀細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷(NK)細胞、T和B淋巴細胞等[51]，其通過激活JAK激酶和信號轉導及轉錄激活蛋白(STAT)轉錄因子途徑發(fā)揮作用，且STAT3是該通路不可或缺的信號分子[52]。發(fā)生炎癥反應時，IL-10對Th17細胞的抑制作用是必要的[53]，且細菌及代謝產物可激活TLRs及其下游信號通路調節(jié)IL-10基因表達[54]。Li等[55]研究表明，嗜酸乳桿菌的補充上調了IL-10的mRNA的表達和抑制壞死性腸炎誘導的干擾素-γ(IFN-γ)大量產生。微生物可通過其代謝產物調控腸道免疫功能，如微生物代謝產物SCFAs能調節(jié)細胞促炎因子和抗炎因子的表達。

Huang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加丁酸梭菌可顯著上調IL-10和抑制IL-17A(IL-17家族的一員)的表達，這可能與其代謝產物丁酸鹽通過介導p38 MAPK的磷酸化進而促進產IL-10的B10細胞生成有關[56]。在結腸炎和多發(fā)性硬化癥的小鼠模型中，戊酸鹽可通過誘導效應T和B淋巴細胞上調IL-10的分泌，并抑制組蛋白乙酰化酶活性[57]；脫氧膽酸(DCA)以劑量依賴方式緩解壞死性腸炎誘導的腸道炎癥和體重損失[7]。以上研究說明，益生菌及其代謝產物通過TRLs和p38 MAPK介導激活下游信號通路調節(jié)IL-10和IL-17表達，緩解炎癥反應，增強宿主自身免疫功能，改善產氣莢膜梭菌誘導的腸道炎癥損傷。

   重組益生菌能夠作為表達無毒抗原的載體，激活機體特異性免疫。Alimolaei等[58]研究發(fā)現(xiàn)，通過將產氣莢膜梭菌α毒素的C末端結構域(cpa247-370)整合到干酪乳桿菌ATCC 393獲得的重組LC-α菌株可作為口服疫苗，有效刺激宿主腸道特異性免疫機能，并產生高水平的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，注射致死劑量的α毒素后，添加重組LC-α治療組小鼠對α毒素的抗性顯著增強。益生菌對產氣莢膜梭菌損傷動物腸道健康的緩解效應見表 1。

2.5 抑制腸上皮細胞凋亡

產氣莢膜梭菌可通過誘導腸上皮細胞凋亡，破壞宿主腸道機能；益生菌可緩解宿主炎癥反應，抑制細胞凋亡。促凋亡蛋白B細胞淋巴瘤蛋白2相關X蛋白(Bax)和抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤蛋白2(Bcl-2)的平衡被破壞后，線粒體膜的通透性增加，導致線粒體膜的細胞色素C(cytochrome C)釋放到胞質中，激活半胱天冬酶-3(Caspase-3)介導的凋亡途徑引起細胞凋亡[59]。

研究表明，患有壞死性腸炎雞的腸組織中Bax/Bcl-2表達比值顯著提高，說明壞死性腸炎可能誘導線粒體介導的細胞凋亡過程，而添加約氏乳桿菌BS15能夠抑制細胞凋亡程度[39]。解淀粉芽孢桿菌CECT 5940能夠抑制雞壞死性腸炎導致Caspase-3和Caspase-8表達上調，從而抑制細胞凋亡[37]。另外，p53是一種多功能蛋白，能夠通過促進凋亡前基因(如Bax)的表達來誘導凋亡，抑制抗凋亡基因[如存活素(survivin)]表達，從而激活半胱天冬酶依賴性途徑，最終觸發(fā)凋亡[60]。復合益生菌能夠抑制壞死性腸炎模型p53信號通路介導的細胞凋亡[47]。

因此，益生菌能抑制雞壞死性腸炎腸細胞線粒體介導的凋亡途徑，與其參與調控p53、Bax和Bcl-2的基因表達有關。

3、小結

產氣莢膜梭菌可通過自身或其分泌的毒素破壞雞腸道物理屏障、化學屏障和微生物屏障，導致雞壞死性腸炎的發(fā)生。而益生菌可改善壞死性腸炎引起的腸道損傷，恢復腸道微生物區(qū)系平衡，提高腸道免疫功能等。但是雞壞死性腸炎的致病機理和益生菌對其的干預機制仍待進一步闡明，如產氣莢膜梭菌毒素激活RIPK1/3介導的細胞壞死的確切機制尚不完全清楚；益生菌緩解產氣莢膜梭菌誘導細胞損傷和凋亡的分子機制是什么；益生菌是否可通過QS系統(tǒng)抑制產氣莢膜梭菌毒素的分泌，這些問題的解決可為雞甚至人壞死性腸炎的防治提供理論參考。另外，靶向緩解產氣莢膜梭菌誘導產生壞死性腸炎的功能益生菌的篩選需要制定統(tǒng)一評價標準，進而為綠色新型飼料添加劑的開發(fā)提供有效的營養(yǎng)干預策略。

作者：童狄清 , 鐘晨 , 高春起

轉自：動物營養(yǎng)學報

參考文獻：略