板藍(lán)根多糖的提取及含量測(cè)定

魁罡

板藍(lán)根（Indigowoad root）為十字科植物菘藍(lán)的根。菘藍(lán)是二年生草本，植株高50～100cm,花期4～5月，果期5～6月。我國(guó)許多地區(qū)都有分分，主產(chǎn)于河北安國(guó)，江蘇如皋、南通等地，各地亦有栽培。板藍(lán)根呈圓柱形，稍扭曲，長(zhǎng)10～20cm，直徑0.5～1cm，氣微，味微甜后苦澀。板藍(lán)根含靛藍(lán)，多種氨基酸，另含有12%氯基酸的蛋白多糖。板藍(lán)根有抑菌作用，對(duì)實(shí)體瘤有一定治療作用。板藍(lán)根多糖25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg腹腔注射可明顯增強(qiáng)小鼠對(duì)二硝基氯苯的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，誘導(dǎo)體內(nèi)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增強(qiáng)脾細(xì)胞的自然殺傷活性，腹腔注射板藍(lán)根多糖50mg/kg，可顯著促進(jìn)小鼠免疫功能，增強(qiáng)抗體形成細(xì)胞功能，增加小鼠靜注碳廓清速率。    本實(shí)驗(yàn)對(duì)板藍(lán)用石油醚、乙醚除去脂溶性雜質(zhì)，用80%乙醇提取除去所含單糖、低聚糖及苷類等干擾性成分后，再用水提醇沉法制得板藍(lán)根粗多糖，并采用酚-硫酸比色法對(duì)其多糖含量進(jìn)行測(cè)定。
1 儀器、試劑及樣品
UV-2401 PC紫外分光光度計(jì)（日本島津），索氏提取器。
葡萄糖（105°C干燥恒重），苯酚（AR），硫酸（AR）。
板藍(lán)根：采自本校藥園，秋季挖根，洗凈晾干，破碎后備用。
2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
2.1 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的配制
    精密稱取干燥恒重的葡萄糖25.2mg，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至250ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，配成濃度為100.8ug/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液備用。
2.2 5%苯酚試劑的配制
    取苯酚100g，加鋁片0.1g和NaHCO30.05g,蒸餾，收集182。C餾份，稱取7.5g，加水150ml溶解，置棕色瓶?jī)?nèi)放冰箱備用。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
    精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml置干燥試管中，分別加水使成1.0ml，再分別加入5%苯酚溶液1.6ml，搖勻，然后加H2SO4 7.0ml，充分搖勻，室溫放置25min，在400～600nm處測(cè)定其最大吸光度，同時(shí)做一空白。結(jié)果見表1

表1不同濃度葡萄糖的吸光度

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(ml)	0.0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7
濃度(ug/ml)	0.00	1.05	2.10	3.15	4.20	5.25	6.30	7.35
吸光度值A(chǔ)	0.000	0.0735	0.1458	0.2235	0.2945	0.3798	0.4420	0.4973

3 多糖的提取及精制
    取板藍(lán)根洗凈，晾干，精密稱取100g，置索氏提取器中，依次用石油醚（60～90°C）、乙醚和80%乙醇回流提取4h。殘?jiān)靡颐选o(wú)水乙醇反復(fù)洗滌，得板藍(lán)根多糖。60°C烘干備用。
4 換算因素測(cè)定
精確稱取60°C干燥恒重的板藍(lán)根多糖20mg，水溶解后定容到100ml量瓶中，搖均，作為多糖儲(chǔ)備液。
精確量取多糖儲(chǔ)備液0.2ml，加水至1ml，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法測(cè)其吸光度值。按下式計(jì)算換算因素。
       f=W/CD
式中：W為多糖重量(ug)，C為多糖液中葡萄糖的重量(ug)，D為多糖的稀釋倍數(shù)。測(cè)得f=4.7829。
5樣品測(cè)定
    精確分別稱取板藍(lán)根粉未0.2g、0.201g、0.203g，用80%乙醇回流2h，殘?jiān)鼡]去溶劑后，繼續(xù)用水回流2h，反復(fù)洗至250ml量瓶中，定容，搖勻成為樣品液。測(cè)定時(shí)，精確吸取樣品液1ml，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣方法測(cè)其吸光度值，按下式計(jì)算多糖含量：
        多糖含量%=CDf/W*100%
式中：C為樣品溶液的葡萄糖的重量(ug),D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，f為換算因素，W為樣品的重量(ug)，測(cè)得平均結(jié)果為0.8099%=0.28%(n=3)
6 回收率測(cè)定
    精密稱取板藍(lán)根粉未0.15g，精密加入板藍(lán)根多糖7mg，再于索氏提取器中用80%乙醇回流2h，殘?jiān)鼡]去溶劑后，連續(xù)用水回流2h，反復(fù)洗至250ml量瓶中定容。搖勻后，清確移取1ml，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行提取和測(cè)定。計(jì)算多糖含量，平均回收率為98.74%,RSD=1.86%(n=5)。
7 討論
    多糖廣泛存在于自然界，是多種中草藥的有效成分之一，具有多種生物活性，是理想的免疫增強(qiáng)劑，它能提高機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能，不僅能促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、M細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，還能促進(jìn)白間素、干擾素、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。目前對(duì)多糖的研究方興未艾，多糖的作用機(jī)理以及生物功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系的研究不斷深入，而且不斷有新的多糖物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。我們從板藍(lán)根中提取出板藍(lán)根多糖，并對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定。研究表明，板藍(lán)根多糖含量不是很高，提取方法有待進(jìn)一步改進(jìn)。板藍(lán)根多糖的結(jié)構(gòu)組成和生理活性也有待進(jìn)一步研究。

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目前多糖的研究還是比較熱的，可惜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定上還有問(wèn)題，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)至少無(wú)法區(qū)別提取的活性多糖和葡萄糖的區(qū)別。中藥還有很長(zhǎng)的路要走，好多東西沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)限制了其發(fā)展，按照新藥太難。最簡(jiǎn)單就是微粉，效果上來(lái)了可惜不符合國(guó)家要求了只能去報(bào)新藥，報(bào)新藥就代價(jià)大了，需要反思。