豬瘟免疫抑制剖析——摘自蔡寶祥

li-liang2008

豬瘟的免疫

蔡寶祥

（南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇南京 210095）

在豬病中，豬瘟（Hog cholera，HC）是危害最大、最受重視的一種病。建國初期，何正禮、方時杰等選用抗原性優(yōu)良的石門系毒株研究改進制成的豬瘟結(jié)晶紫疫苗效果明顯，廣泛應(yīng)用后對控制當時豬瘟的流行曾起過一定作用。1956 年周泰沖、袁慶志等研制成功的中國系（C 系）豬瘟兔化弱毒疫苗，證明有高度安全性和優(yōu)良的免疫原性，且無殘毒，毒力不返強。自1 9 5 7 年起，除在我國廣泛應(yīng)用外，并已推廣到歐亞很多國家，使這些國家控制或消滅了豬瘟。該疫苗被公認為目前世界上比較理想的豬瘟疫苗、這是我國獸醫(yī)科學工作者的一大杰出貢獻。

我國在豬瘟免疫程序、免疫診斷、免疫監(jiān)測以及豬瘟病毒的遺傳變異等方面的研究都取得了顯著成果。但是現(xiàn)在豬場免疫中卻存在很多問題，其中因為豬群感染情況復(fù)雜，免疫操作效果往往難以保證，主要原因有以下幾項：病原的遺傳變異弱毒疫苗的普遍使用改變了豬瘟病毒（H C V ）原有的生態(tài)環(huán)境和病毒群落。從20 世紀70 年代末開始，全世界HC 流行的特點均發(fā)生了重大變化，以溫和型HC 為主。而近年來我國又出現(xiàn)了HC 疫情的反彈現(xiàn)象，許多豬場的免疫豬群頻繁發(fā)病。因此，了解H C V 的遺傳變異情況，了解HCV 疫苗毒與現(xiàn)流行毒之間的差異，對于防制 HC 是十分重要的。1986年 Lowings對世界上 20多個國家的115株HCV進行了序列比較、中和單抗反應(yīng)性及內(nèi)切酶分析后，將115株毒劃分成2 個群（或血清亞型）。血清型1 有2 個亞群，主要包括Brescia 株（荷蘭）、疫苗毒株和60 年代流行毒；血清型 Ⅱ有3 個亞群，主要包括Alfort 株（德國）和近10年來的流行毒。在此基礎(chǔ)上，1999 年Sakoda 通過對4O 余株HCV 流行毒的序列分析，將HCV 分為 3 群：HCVI 稱為古典HCV，以Brescia株為代表HCV2以Alfort株為代表HCV3與上述2 個群均有較大差異，包括日本、泰國和中國臺灣等國家和地區(qū)20 世紀70～90 年代的流行毒株。

我國開展HCV 分子流行病學的研究工作雖然較遲，但在蘭州獸醫(yī)研究所和解放軍軍需大學等研究單位的不懈努力下，已使我國H C V 遺傳發(fā)生關(guān)系全貌的系譜圖日漸清晰。軍需大學獸醫(yī)研究所采用RT-PCR 方法，從我國10 個省、市、自治區(qū)收集23 個HCV 流行毒株中，擴增了HCV E2 基因中主要抗原位點編碼區(qū)。對各擴增片段進行了序列測定，通過計算機分析構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹，并確定了它們之間的遺傳相關(guān)性。結(jié)果表明，23 個流行毒株中的 18 株屬基因 Ⅱ群，占78.26％；另外5 個流行株與傳統(tǒng)的石門系強毒，兔化弱毒株屬基因Ⅰ群，占21.74％。兩群間測序區(qū)的核酸同源性只有78.9％。此外，根據(jù)序列差異程度將基因Ⅱ群流行株分為3 個亞群，各基因群HCV 在地域分布上末發(fā)現(xiàn)明顯的特征性。該研究初步揭示了我國較大范圍內(nèi)流行的HCV毒株與傳統(tǒng)的石門強毒和疫苗用兔化弱毒在抗原基因上存在較大的差異，以及我國H C V 流行株在地域分布的多樣性。近期HCV 流行毒與古典HCV 之間已有較大差異（核酸和氨基酸同源性分別為82.2％～84.3％和87.9％～90.0％），但根據(jù)中國獸藥監(jiān)察所進行的豬瘟兔化弱毒疫苗對不同HCV 野毒株的免疫保護相關(guān)性研究結(jié)果表明：雖然在我國不同地區(qū)所分離的HCV 野毒株在其病原生物學上有所差異，但用我國目前使用的豬瘟免化弱毒疫苗免疫的豬完全能夠抵抗這些野毒的攻擊。結(jié)果再一次證明：我國現(xiàn)用的豬瘟兔化弱毒疫苗對預(yù)防目前流行的H C V 是完全有效的。

疫苗的質(zhì)量問題

我國研制的中國系（C系）豬瘟兔化弱毒是國際公認的最佳疫苗用株，很多歐亞國家采用了C系弱毒苗有效地控制了HC 流行。但我國近年來常有免疫失敗的報道，其原因雖然很多，疫苗的質(zhì)和量有著重要的影響。疫苗免疫效果通常以防止臨床感染為標準。應(yīng)用這一標準時，常有部分豬免疫后，抗體水平不能達到防止亞臨床感染水平，這部分豬感染強毒后常可引起亞臨床感染。此種亞臨床感染豬雖無明顯癥狀，但在其存活期終生帶毒、散毒，成為H C V 主要儲存宿主，剖檢可見胸腺萎縮，淋巴結(jié)腫大。這些豬的存在，便可形成HC常發(fā)地區(qū)。因此，專家指出，疫苗應(yīng)以能保護防止亞臨床感染為標準。

用不同劑量的C 株苗免疫豬，證實免疫劑量與保護水平密切相關(guān)。劑量不足時，攻毒后不能阻止強毒在體內(nèi)復(fù)制和帶毒。免疫劑量提高到8 0 ～1 0 0 P D 5 0 （約3 2 0 ～4 0 0 R I D ，R I D 為兔體反應(yīng)量），攻毒后能制止亞臨床感染，所有耐過豬均不帶毒。目前歐洲為消滅H C 亞臨床感染，多采用加大免疫劑量的方法。歐洲藥典規(guī)定用C 株疫苗免疫時，肌肉注射劑量為100PD50（400RID ）。我豬瘟細胞苗出廠檢驗以5 萬倍稀釋能致兔體熱反應(yīng)為合格，即每毫升原液含5 萬RID。規(guī)定的免疫劑量為150RID，折算為37 PD50。這一劑量遠低于國際標準，顯然在HC 不穩(wěn)定地區(qū)應(yīng)用這一劑量，不足以切斷HC 亞臨床感染引起的惡性循環(huán)。

H C V 和牛病毒性腹瀉病毒（B V D V）2 種瘟病毒之間有較密切的抗原性和血清學關(guān)系。兩者同源性很高，能互相誘導一定程度的同源病毒抗體。在西歐國家，豬B V D V 的感染率很高（2 0 ％～4 0 ％）。B V D V 感染妊娠母豬可引起繁殖障礙，病毒可經(jīng)胎盤傳染胎兒，使所產(chǎn)仔豬構(gòu)成亞臨床感染。國內(nèi)生產(chǎn)廠家反映，用家兔測定牛睪丸原代細胞生產(chǎn)的豬瘟兔化弱毒疫苗效價時，各批次間相差懸殊。究其原因有多種，但其中最值得注意的是瘟病毒（B V D V ）污染。因為瘟病毒在體外培養(yǎng)大多不產(chǎn)生CPE，故不易引起檢驗人員注意。污染主要來源是小牛血清，從瘟病毒先天感染的小牛分離的血清含有感染性病毒，常規(guī)的熱滅活又不能確保瘟病毒滅活。用BVDV 污染的HC 疫苗免疫母豬后，仔豬發(fā)生類似先天性HC 感染，死亡率增加，因此給生產(chǎn)造成很大損失。

疫苗的運輸、保存、使用不當，亦易影響免疫效果。豬瘟凍干苗應(yīng)在低溫條件下運輸和保存，稀釋后應(yīng)立即使用，不能存放過久。有人曾在夏季一個市場防疫注苗點進行試驗，早晨剛稀釋的疫苗經(jīng)檢驗完全符合出廠標準，即每頭份含150RID，但到傍晚，自注苗點抽檢最后剩下1 瓶稀釋的疫苗檢測，每1 頭份只有15個兔體反應(yīng)量，在Id中效價已損失90％。因此，稀釋后的疫苗如不能立即用完，應(yīng)放在冰瓶內(nèi)低溫保存。此外，疫苗注射操作過程中的失誤，如使用失真空的疫苗或過有效期的疫苗；消毒不嚴，造成潛伏期病毒的傳播等都會影響疫苗的免疫效果。

免疫程序問題

我國各地對HC 的防制工作一般都很重視，但有些地區(qū)仍時有HC 暴發(fā)流行，免疫失敗的現(xiàn)象也常有發(fā)生。其原因除免疫劑量不夠，免疫覆蓋率偏低以外，免疫程序不盡合理也是一個重要因素。為了尋求更加科學、合理、有效的豬瘟免疫程序，各地進行了大量試驗研究。免疫程序的關(guān)鍵是排除母源抗體干擾，確定合適的首免日齡。門常平等（1982）報道母豬在配種前免疫接種的，所產(chǎn)仔豬血中母源抗體的中和效價，3 ～5 日齡時約為1 :64～128。母源抗體的半衰期約10d，仔豬20 日齡前可得到母源抗體的保護。25 日齡后保護力下降，至40 日齡已完全喪失對強毒的抵抗力，45 日齡前后母源抗體效價已降至l：4～8 豬瘟疫苗的仔豬首免日期，最好選定在仔豬持有的母源抗體不會影響疫苗的免疫效果而又能防御病毒感染的期間，即母源抗體為1 ：8 ～64 時。因此提出25 日齡和6 5日齡2 次免疫的建議，此種免疫程序目前已為多數(shù)豬場采用。如在母源抗體效價尚高時接種疫苗，即會被母源抗體中和掉部分弱毒，阻礙疫苗弱毒的復(fù)制，仔豬就不能產(chǎn)生堅強的主動免疫力。如果有其他免疫抑制疾病的影響，免疫程序還需要另做調(diào)整，而且目前豬群一般不只受一種疾病威脅。如豬繁殖與呼吸綜合征（P R R S ）在豬群中的存在，會使豬體免疫力下降，從而影響HC 的免疫保護力。PRRS 所引起的最顯著病理變化是嚴重損傷肺泡巨噬細胞，造成其大量破壞，并伴有循環(huán)淋巴細胞及黏膜纖毛清除系統(tǒng)的破壞，從而抑制免疫力，使豬對各種繼發(fā)感染易感。PRRS 感染產(chǎn)生的免疫抑制，也可以惡化慢性傳染性疾病，并使豬對其他疾病如豬瘟等各種疫苗的免疫應(yīng)答下降，造成免疫失敗。

有效控制和消滅HC 的對策 第一，加強H C 診斷和免疫監(jiān)測 典型HC 可主要根據(jù)臨床癥狀和病理變化作出診斷，實驗室診斷為輔助手段。非典型HC 由于癥狀不明顯和缺乏特異性特征，通常需取決于實驗室診斷。 實驗室診斷目前常用的方法有： ①冰凍組織切片（或觸片）的直接熒光抗體（F A ）試驗。許多國家和地區(qū)已將該法作為執(zhí)行消滅HC 規(guī)劃的法定診斷方法，此法簡便、快速可靠。作為FA 試驗的樣品應(yīng)采自病死豬的扁桃體、脾、腎或回腸末端。②將病豬扁桃體和脾制成20g／L的混合勻漿后接種PK-15 細胞24～72h 以后，用FA 試驗或酶標抗體檢查證實培養(yǎng)物中的病毒（H C V 無C P E ）。此種病毒分離方法比FA 更為敏感。③經(jīng)典的HC 診斷方法是接種易感豬和免疫豬，或用兔體交叉免疫試驗（可區(qū)別兔毒和強毒）。④間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗，可作為HCV 感染豬血清抗體的檢測與分析。⑤為區(qū)分HCV 和BVDV 需借助單克隆抗體技術(shù)和核酸探針技術(shù)。 為了弄清群體的免疫水平和疫苗免疫效果，必須加強H C 免疫監(jiān)測。杜念興等（1 9 9 8）建立的P P A - E L I S A ，曾對抗體不同水平的豬進行攻毒保護試驗。結(jié)果OD490 值在0 ．3 以上1 0 0 ％保護；≥ 0 ．1 7 至≤ 0 ．3 之間者，保護率在75 ％左右。據(jù)此制定了群體總保護率的估算公式：群體總保護率＝（≥ 0.3 的頭數(shù)＋≥ 0.17 至<0.3 的頭數(shù)Χ 75％）/ 總頭數(shù)免疫良好的免疫群體保護率多在90% 以上，總保護率小于50％者為免疫無效或HC 不穩(wěn)定地區(qū)，需加強免疫或采取措施消除不穩(wěn)定因素。 總之，做好免疫監(jiān)測是減少我國HC 發(fā)生的重要手段。應(yīng)用免疫檢測可隨時掌握豬群的免疫狀態(tài)，制定適合于該豬場合理的免疫程序，并隨時淘汰免疫耐受豬（疫苗接種后不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生低水平抗體的豬），保持豬群的整體免疫。此外，結(jié)合HCV 抗原檢測，堅決淘汰隱性感染或潛伏感染的種公豬和母豬，消除引起仔豬先天感染和免疫耐受的傳染源。

第二，制定合理的免疫程序和適當加大免疫劑量

目前國內(nèi)還沒有統(tǒng)一的H C 免疫程序。劉勁松等（1991）在相同條件下對5 種常用的HC 免疫程序進行了比較研究。結(jié)果表明：在HC 控制區(qū)采用1 月齡一次免疫或2月齡一次免疫；在HC 未控制區(qū)采用超前免疫或1 月齡一次免疫。母豬的免疫應(yīng)避開配種和妊娠期，以免引起胎盤感染或超前免疫時仔豬發(fā)生過敏性休克（可能由于母源抗體過高）。林毅等（2 0 0 0 ）提出，由于現(xiàn)在一些規(guī)?；?a href="http://www.ffers.com.cn/pigs/" target="_blank" class="relatedlink">養(yǎng)豬場實行28 日齡早期斷奶，為便于生產(chǎn)實際操作和盡量減少應(yīng)激次數(shù)，試驗制定了28 日齡首免；70 日齡二免2 頭份豬瘟疫苗的免疫程序。在母源抗體較高或未流行過HC 的豬場，選用此程序免疫較好。吳楚泓（2 0 0 0 ）在廣東廣三保養(yǎng)豬公司的試驗結(jié)果表明，在無豬瘟流行的地區(qū)，仔豬在65 日齡時進行一次性大劑量（5 頭份）免疫，抗體有效效價高于2 次免疫豬（35 日齡首免3 頭份；65 日齡二免5 頭份），與2 次免疫相比，既節(jié)省免疫費用，又可獲得較好的免疫保護力。蔡葵蒸等（2002）試驗指出，在豬瘟威脅區(qū)，免疫母豬所產(chǎn)仔豬以28日齡首免4 頭份疫苗，55日齡二免2頭份疫苗的免疫程序效果較為可靠。

為了排除母源抗體的干擾，使仔豬獲得較強免疫力，對初生仔豬進行超前免疫（又稱乳前免疫或零時免疫）已達成共識，并在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，且日漸成熟。一般認為在超前- 次免疫后應(yīng)在70 日齡前后進行第2 次免疫，才能保證絕大多數(shù)豬具有能抵抗HCV 感染的抗體水平。多數(shù)學者認為適當提高免疫劑量有利于提高抗體水平，同時加大劑量亦可中和一定的母源抗體?？晒﹨⒖嫉拿庖邉┝繛榉N豬4～5 頭份；仔豬2 ～3 頭份；仔豬母源抗體在1 ：32 以上時（2 5 日齡左右），以4 頭份疫苗劑量的免疫效果最佳。

第三，豬瘟疫苗的改進

豬瘟弱毒疫苗的廣泛應(yīng)用，對于控制HC 的流行起到了關(guān)鍵作用。但是，由于用這類疫苗免疫后并沒有徹底阻斷HCV 的傳遞途徑，H C V 野毒仍然存在并以低水平傳播，致弱疫苗毒也存在因突變或與野毒發(fā)生重組而造成毒力返強的機率。另一方面，弱毒疫苗的普遍使用，促使了H C V 的變異這一事實已為近期流行毒與疫苗毒在分子水平上存在較大差異所證明。因此，研制可克服傳統(tǒng)疫苗不足之處的新型疫苗是十分必要的。

①基因工程亞單位疫苗

利用真核細胞高效表達系統(tǒng)來表達HCV 免疫蛋白，并以此表達產(chǎn)物為抗原可制造疫苗。桿狀病毒（baculovirus）昆蟲細胞系統(tǒng)可高水平表達外源蛋白基因，而且大部分蛋白質(zhì)的加工過程與哺乳動物細胞相同。Hulst 等（1993）將HCVE2 基因CDNA 重組入核型多角體病毒（ACNPV），并在SF21 細胞中表達。用20～ 100 mg 的表達蛋白免疫豬，可抵抗100LD50 的HCV 強毒攻擊，其誘導產(chǎn)生的中和抗體水平遠高于由弱毒疫苗免疫產(chǎn)生的水平。目前，該蛋白的表達水平已被提高至60 μ g/mL，該疫苗于1998 年被列入歐洲藥典。由于該疫苗生產(chǎn)技術(shù)具有安全、穩(wěn)定、可規(guī)?；葍?yōu)點，同時又可根據(jù)流行毒的變化，更換合適的E2 基因，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

②病毒活載體疫苗

以無致病力或低毒力的痘苗病毒或偽狂犬病病毒為載體，將HCVE2 基因與之重組研制出的基因重組疫苗，免疫動物后可對2 種病毒產(chǎn)生良好的保護力。但對此類疫苗的安全性和實用價值目前還有爭議。因為人類至今還不了解病毒的自然發(fā)生及變異機制，一旦將該病毒放入自然界中，有可能衍變出對人和動物有危害的病毒變種。

③核酸疫苗

即D N A 疫苗。將外源基因克隆至真核質(zhì)粒表達載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA 直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達。產(chǎn)生的抗原激活機體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。近年來有關(guān)質(zhì)粒DNA 疫苗在人類及動物產(chǎn)生預(yù)防和治療作用的研究報道不斷增加，應(yīng)用范圍也逐漸擴大。在豬瘟D N A 疫苗方面，解放軍軍需大學作了初步研究，成功地保護了豬瘟強毒對豬的攻擊。但要使DNA 疫苗的研制獲得成功并得到推廣應(yīng)用，還有很長的路要走。

第四，認真制定執(zhí)行控制和消滅HC 規(guī)劃

我國曾多次制定控制和消滅HC 規(guī)劃，但由于種種原因未取得預(yù)期成效。美國在上世紀50 年代，HC 流行也很嚴重。1961 年美國農(nóng)業(yè)部開始組織全國范圍內(nèi)消滅 HC，同年參眾兩院通過立法消滅HC，并由總統(tǒng)批準了國家消滅HC計劃。經(jīng)過16 年的努力，1978 年宣布在全國范圍徹底消滅了HC。16 年間州和聯(lián)邦共撥款1．4 億美元用于執(zhí)行消滅HC 計劃，而16 年間豬場由于控制了疫病獲利達15 億美元。且由于消滅了H C ，美國豬產(chǎn)品可重返國際市場，所獲利潤遠大于滅病開支。雖然兩國國情、疫情不同，但美國的滅病經(jīng)驗仍有可借鑒之處。

huangdy2006

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