應(yīng)用PCR技術(shù)診斷豬圓環(huán)病毒2型與豬偽狂犬病病毒混合感染＿＿＿陳義祥等

kinki0396

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV-2）是從豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post?weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）病豬中分離的豬圓環(huán)病毒，又稱(chēng)PMWS相關(guān)PCV。一般由PCV-2單獨(dú)引起的疾病比較輕微，但常常由于并發(fā)或繼發(fā)細(xì)菌或病毒感染而使死亡率大大增加，病死率可達(dá)25%以上。PCV-2感染和引起的疾病已呈全球分布，已成為危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的主要疾病之一。我國(guó)北京、上海、江蘇等地都已證實(shí)有該病毒的存在，PCV-2具有免疫抑制特性，PCV-2感染可以引起繼發(fā)性免疫缺陷，發(fā)病或感染豬至少有短暫的免疫抑制現(xiàn)象而不能激發(fā)對(duì)其他病原體的有效免疫應(yīng)答。豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）又稱(chēng)豬皰疹病毒Ⅰ型，可引起家畜和某些野生動(dòng)物的傳染病，其中對(duì)豬的危害最大，主要特征是發(fā)熱和腦脊髓炎，新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，成年豬多為隱性感染，妊娠母豬表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊，尤其是以產(chǎn)死胎較為嚴(yán)重，目前已有40多個(gè)國(guó)家報(bào)道發(fā)生本病，每年給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失，PRV已在我國(guó)廣泛存在。目前，關(guān)于PCV-2和PRV病原學(xué)常規(guī)檢測(cè)方法常常存在特異性、敏感性差、操作技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)。PCR方法具有快速、特異、敏感的特點(diǎn)，已廣泛用于許多病毒和細(xì)菌病的快速診斷，PCV -2和PRV的分子生物學(xué)方面的研究已取得了很大的進(jìn)展。本試驗(yàn)在結(jié)合流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖檢的基礎(chǔ)上，應(yīng)用PCR技術(shù)將桂林市和貴港市兩地送檢的病料，快速、準(zhǔn)確地診斷為PCV-2和PRV的混合感染。?
1 材料與方法
1．1 病料處理 5月22日與8月10日，從廣西自治區(qū)桂林市和貴港市兩大規(guī)?；i場(chǎng)無(wú)菌采取發(fā)病豬的脾臟、淋巴結(jié)、腦，-20℃保存。?
1．2 主要試劑 SDS購(gòu)自AMRESCO、Tris 飽和酚購(gòu)自TBD.BIO；氯仿、無(wú)水乙醇購(gòu)自上海；dNTPs、TaqDNA聚合酶購(gòu)自MBI公司；DL2000 DNA Marker、蛋白酶K購(gòu)自TaKaRa公司。?
1．3 引物合成 參考蘆銀華根據(jù)PCV-2全基因序列設(shè)計(jì)引物，C1：5′-?CCG CGG GCT GGC TGA ACT T-3′； C2：5′-ACC CCC GCC ACC GCT ACC-3′預(yù)期擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為1154 bp。參考中華人民共和國(guó)豬偽狂犬病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，引物序列為：PR1：5′-?CAG GAG GAC GAG CTG GGG CT-3′； PR2：5′-?GTC CAC GCC CCG CTT GAA GCT-3′，擴(kuò)增豬偽狂犬病病毒基因中434~651堿基對(duì)（bp）之間217 bp片段。以上兩對(duì)引物均由大連寶生物公司合成。
1．4 病料中總DNA的抽提分別取病豬脾臟、淋巴結(jié)及腦，用研磨器充分研磨，用Hank's液1∶5稀釋?zhuān)磸?fù)凍融3次以上，8 000 r/min離心10 min，取上清500 μl，加30 μl 10% SDS和10 μl 20 mg/ml蛋白酶K，50℃水浴搖床上放置2 h。加入等量的飽和酚，12 000 r/min離心?5 min?。取上清液，加入等量的酚∶氯仿（1∶1），渦旋20 s，12 000 r/min離心?5 min。取上清液，加入等量的氯仿，振蕩混勻，?12 000 r/min? 離心5 min。取上清液，加入2倍體積的無(wú)水乙醇和1/10上清液體積的3 M NaAc(pH?5.2?)，使其混勻。-20℃放置60 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清，用75%無(wú)水乙醇沖洗沉淀2次，晾干，加入20 μl雙蒸水溶解即為模板。?
1．5 PCV?2目的基因片段的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5.0 μl，dNTP(2.5 m
mol/L) 4.0 μl，MgCl?2(25 mmol/L) 3.0 μl，上下游引物(25 pmol/μl)各1.0 μl，cDNA 5.0 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl) 0.5 μl，加H?2O至50 μl。預(yù)變性94℃ 10 min進(jìn)入循環(huán)，94℃ 1 min，53℃ 1 min, 72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察目的片段。
1．6 PRV目的基因片段的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μl，MgCl?2(25 mmol/L) 2.0 μl，PR1和PR2(25 pmol/μl)各0.5 μL，cDNA 4.0 μl，0.25 μl TaqDNA聚合酶(5 U/μl)，加H?2O至25 μl。預(yù)變性94℃ 3 min進(jìn)入循環(huán)，94℃ 1 min，65℃ 1 min,72℃ 1 min, 40個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察目的片段。
2 結(jié)果 ?
2．1 PCV-2的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用PCR技術(shù)，利用合成的PCV?2特異性引物，從兩頭病豬的
脾、淋巴結(jié)混合病料中均擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1 154 bp的特異目的基因片段，與陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增的片段大小一致（圖1）。
圖1 PCV?2目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖
1.桂林病料；2.貴港病料；3.標(biāo)準(zhǔn)PCV?2；4.DL2000 DNA Marker
2．2 PRV的PCR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用PCR技術(shù)，利用診斷PRV特異性引物，分別從病豬的腦組織中擴(kuò)增出了長(zhǎng)度約217 bp目的基因片段，與預(yù)期的結(jié)果一致，表明所檢測(cè)的病料為PRV陽(yáng)性。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）。
圖2 PRV目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖
1.桂林病料；2.貴港病料；3.標(biāo)準(zhǔn)PCV；4.DL2000 DNA Marker
3 討論 ?
3.1 近年來(lái)，關(guān)于PCV?2和PRV的診斷方法有病毒分離鑒定、ELISA以及IFA等常規(guī)技術(shù)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）診斷技術(shù)，PCR技術(shù)用于診斷PCV?2和PRV具有：速度快、特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，大大的提高了這兩種病毒病的檢出率和準(zhǔn)確性，另外PCR技術(shù)對(duì)于PCV?2和PRV的早期感染、潛伏期感染和持續(xù)性感染的診斷均具有重要的意義。?
3．2 根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖檢的初步診斷，應(yīng)用PCR技術(shù)，從廣西桂林某規(guī)模
豬場(chǎng)的病料中同時(shí)擴(kuò)增出PCV-2和PRV特異的目的基因片段，從而確診為PCV?2和PRV混合感染。目前，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)從廣西區(qū)的許多地市檢測(cè)并分離到PCV?2和PRV，而這次是從豬體內(nèi)同時(shí)檢測(cè)到PCV-2和PRV的混合感染，可見(jiàn)疾病的發(fā)展情況日趨復(fù)雜，在疾病的預(yù)防和診斷過(guò)程中應(yīng)引起重視。?
3．3 控制和消滅豬偽狂犬病所面臨的主要困難是偽狂犬病的潛伏感染問(wèn)題，感染豬康復(fù)后往往會(huì)長(zhǎng)期帶毒，且有散毒的危險(xiǎn)，在機(jī)體受到體內(nèi)外因素的剌激時(shí)，病毒往往被活化，并由帶毒動(dòng)物傳給其他動(dòng)物，引起疾病暴發(fā)。所以要控制本病的發(fā)生，只有做好免疫接種，完善飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格防止病毒傳入健康豬群，尤其是引進(jìn)種豬時(shí)必須經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)病后才能引進(jìn)。
3．4 根據(jù)近年來(lái)歐美各國(guó)在控制PMWS的經(jīng)驗(yàn)表明，對(duì)PCV-2感染的特異性控制措施很難奏效，目前，還沒(méi)有有效的疫苗可以用來(lái)預(yù)防PCV-2的感染。因此，只有通過(guò)對(duì)豬群加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高營(yíng)養(yǎng)水平，降低應(yīng)激因素，完善用藥方案，防止繼發(fā)性感染，作好其他疾病的免疫接種等措施來(lái)預(yù)防和控制PCV-2的感染。?






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vetxy

堅(jiān)決反對(duì)用PCR作為診斷PCV2的依據(jù)。
之前的帖子已經(jīng)有討論了，這里不再鰲述原因了。

朱良

還是不要用PCR作為診斷PCV－２的依據(jù)。
同意樓上的觀點(diǎn)！

豬爪爬天下

真是郁悶啊,不是看不懂,是看懂了感到害怕.