清涼沖劑對雞免疫功能的影響

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清涼沖劑對雞免疫功能的影響 胡艷欣1佘銳萍1馬衛(wèi)明4肖沖2王占赫1許劍琴1劉鳳華3 *     （1 中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院北京 100094；2中國農(nóng)業(yè)大學生物學院北京 100094；3北京農(nóng)學院北京 102206 ；4 山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院山東泰安 271018)

摘要：本實驗所采用的清涼沖劑，是以石膏為主要成分的中藥復方。實驗動物選擇體重基本一致的農(nóng)大三號雛雞60只，隨機平均分為2組。實驗從第7日齡起，至49日齡時止，周期共計6周。其中實驗組飼喂中藥煎劑（濃度為1g/ml），喂藥量與飼料量比為1：1000；對照組不喂藥，兩組均正常飲水。在第7，21，35，49日齡時，兩組分別剖殺5只，取胸腺、法氏囊、脾臟等免疫器官，稱量并計算免疫器官指數(shù)；每周進行心臟采血,用血凝抑制法(HI)測定各組血清NDV抗體水平；采用腹腔巨噬細胞功能測定法，計算其吞噬百分率和吞噬指數(shù)。實驗結果顯示：與對照組相比，免疫器官指數(shù)、NDV抗體水平以及腹腔巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)各項指標實驗組均明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01)。說明清涼沖劑可以有效增強雞的免疫功能。 關鍵詞：清涼沖劑免疫功能雞 Effect of Qingliang Chinese-Herb decoctionon chickenimmunological function HU yan-xin 1,SHE rui-ping1, MA wei-ming4,XIAO Chong2 , Wang zhan-he1,Xu jian-qin1,LIU feng-hua3 (1 College of Veterinary Medicine , China Agricultural University , Beijing 100094 ,2 College of Biology, China Agricultural University , Beijing 100094 ,3Beijing Agricultural College ,Beijing 102206,China 4 Shandong Agricultural University,taian,271018 ) ［Abstract］Sixty healthy seven-day-old layers were divided into two groups at random , thirty for each.. Qingliang Chinese-Herb decoction were orally administered to chicken of Group Ⅰ. Group II is the control group ..At the age of 7, 21, 35, 49 days , 5 layers of each group were sacrificed and index numbers of thymus , spleen and bursa Fabricius were calculated. Every week , HI test result s with heart blood were recorded to calculate NDV antibody titers. At the age of 49 days, phagocytic percentage and phagocytic index were observed. The result s demonstrated that Qingliang Chinese-Herb decoction could increased the spleen , thymus and bursa Fabricius weight and phagocytic percentage and phagocytic index. It could also significantly enhance NDV antibody titers. It is indicated that Qingliang Chinese-Herb decoction could improve the immunity in chicken. ［Key Word］Qingliang Chinese-Herb decoction,immunological function , chicken 清涼沖劑是以石膏為主要成分的抗熱應激中藥方劑，其作用機理是通過增強散熱和提高機體免疫水平這兩個方面來達到抗熱應激的目。石膏又名白虎，是中醫(yī)清熱瀉火治氣分實熱證的要藥，[1]在20世紀80年代前主要是通過研究石膏有無退熱作用，來對其作用機制進行探討。在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，石膏亦能夠非特異性增強動物細胞及體液免疫水平。[2，3，4] 本研究將觀察服用清涼沖劑后，雞免疫器官指數(shù)、NDV抗體水平以及腹腔巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)各項指標的變化，來探討含有石膏成分的清涼沖劑對雞免疫功能的影響。從而為清涼沖劑的開發(fā)奠定一定的理論基礎。 1. 材料與方法 1.1材料 1.1.1 藥物及主要試劑 清涼沖劑，主要成分以石膏為主，藿香等中草藥為輔。采用傳統(tǒng)中藥煎煮方法將中草藥制成水煎液，并濃縮成1g/ml，作為實驗藥劑。雞新城疫克隆C30活疫苗（SPF）、雞新城疫低毒力活疫苗（Lasota 系）(遼寧省益康生物制品廠產(chǎn)品)，購自中國獸藥監(jiān)察所。5 %的雞紅細胞懸液，由筆者所在實驗室自行制備。 1.1.2 實驗動物與飼養(yǎng)管理 農(nóng)大3號1日齡公雛，購自北京昌平區(qū)雞場。雛雞飼喂北京震亞飼料廠生產(chǎn)的蛋雛雞全價料（ME＝12.18MJ/kg，CP＝18.45％），自由采食與飲水。光照時間1～3日齡為23小時/天，從4日齡起，每天減少2h，直至8小時/天時為止。雞舍內(nèi)溫度1～3日齡為30～33℃，4～7日齡為28～30℃，以后每周降低2℃，直至18～20℃為止。 1.2實驗方法 1.2.1免疫器官指數(shù)的測定和計算 在7、21、35和49日齡，實驗組和對照組各隨機抽取5羽試驗雞，稱重后迅速處死并完整剝離每只雞的胸腺、脾臟和法氏囊，稱重。按照下述公式計算每只雞的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)：免疫器官指數(shù)= 免疫器官重(mg)/體重(g)。[5]用MINITAB Release 10.1軟件進行平均數(shù)運算和方差計算，分析各實驗組各個指標之間的差異顯著性。（下同） 1.2.2NDV血清抗體水平的測定 雞新城疫的免疫采用雞新城疫克隆C30活疫苗（SPF），于7日齡滴鼻點眼首免，1頭份/只；21，35日齡時用雞新城疫低毒力活疫苗（Lasota 系）飲水進行二免和三免，2頭份/只。分別于7、14、21、28、35、42和49日齡采血分離血清，實驗組與對照組分別隨機抽取10只雞。按常規(guī)方法用96孔“V”形血凝板進行血凝抑制試驗（HI），測定NDV血清抗體的血凝抑制效價，以log2表示。 1.2.3雞腹腔內(nèi)巨噬細胞吞噬功能的測定 取49日齡實驗組和對照組雞各5只。檢測前1天每只雞腹腔注射質量分數(shù)為0. 5 %的淀粉生理鹽水1.0ml，檢測時每只雞腹腔注射體積分數(shù)為5 %的雞紅細胞懸液1.0 ml；30min后頸靜脈放血致死雞只。經(jīng)腹膜注入生理鹽水3.0ml , 輕揉腹部, 然后吸出腹腔洗液1.0 ml，平均滴于2 片載玻片上，37℃溫育，PBS漂洗，除去未貼片細胞，晾干，丙酮-甲醇（1∶1）固定，姬姆薩染色，每片油鏡下計數(shù)200 個巨噬細胞所吞噬的雞紅細胞數(shù)。[6,7,8]按下列公式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)： 2.實驗結果 2.1清涼沖劑對免疫器官指數(shù)的影響 不同時期各組雞免疫器官指數(shù)見表1。 表1清涼沖劑對雞免疫器官指數(shù)的影響 (，n=5)單位：% 7日齡 21日齡 35日齡 49日齡 胸腺指數(shù) 實驗組 6.63±0.05 7.11±0.12 7.95±0.19* 7.50±0.26* 對照組 6.63±0.05 7.50±0.11 5.72±0.13 4.62±0.06 脾臟指數(shù) 實驗組 1.11±0.03 1.45±0.01 1.86±0.05 2.23±0.04 對照組 1.11±0.03 1.27±0.02 1.75±0.05 1.71±0.03 法氏囊指數(shù) 實驗組 3.48±0.03 6.02±0.14 4.53±0.15 3.49±0.09 對照組 3.48±0.03 6.16±0.09 4.12±0.17 2.38±0.16 （表中* 表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01） 從表1可以看出，服用清涼沖劑之后（7日齡開始），與對照組相比較，實驗組雞各免疫器官指數(shù)均有所增高。到35日齡和49日齡的時候，實驗組雞胸腺指數(shù)顯著高于對照組，P<0.05。脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)差異性分析均為不顯著（P>0.05），但均高于對照組，說明清涼沖劑可以促進免疫器官的發(fā)育。 2.2清涼沖劑對NDV血清抗體水平 不同時期各組雞NDV血清抗體水平見圖1。 圖1實驗期間雞NDV血清抗體變化曲線圖 從圖1可以看出，7日齡首免后，NDV血清抗體水平逐漸提升，21日齡進行二免，抗體水平繼續(xù)提升，至35 日齡有所下降，之后又回升。在整個實驗期間，實驗組抗體水平始終高于對照組，但在14～28日齡期間，實驗組抗體水平與對照組差異不顯著（P>0.05）；在35日齡，實驗組抗體水平與對照組差異極顯著（P<0.01）；至42日齡，實驗組抗體水平高于對照組，差異顯著（P<0.05）； 49日齡，又回到了差異不顯著的水平（P>0.05）。 2.3清涼沖劑對雞腹腔內(nèi)巨噬細胞吞噬功能的影響 圖2 清涼沖劑對巨噬細胞吞噬百分率、吞噬指數(shù)的影響 油鏡下，巨噬細胞體積明顯大于雞紅細胞，且胞漿呈淡粉色（圖3）。從圖2可以看出，實驗組雞腹腔內(nèi)巨噬細胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)都顯著高于對照組（P<0.05），說明清涼沖劑可以提高雞腹腔內(nèi)巨噬細胞的吞噬能力。    圖3巨噬細胞吞噬紅細胞后的形態(tài)結構（姬姆薩染色，100×）：A圖表示未吞噬紅細胞的巨噬細胞，B圖表示正在吞噬紅細胞的巨噬細胞，C圖表示已吞噬紅紅細胞的巨噬細胞（箭頭所示）。 3小結與討論 石膏屬清熱類藥，主要成分是含水硫酸鈣，主要功效是清熱瀉火，防煩止渴。在免疫方學面，發(fā)現(xiàn)石膏及以石膏為主的復方，可明顯增加免疫器官重量，[8]增強細胞吞噬功能，增加機體細胞免疫功能。[2,3,9] 本研究已經(jīng)證實以石膏為主要成分的清涼沖劑可以顯著提高機體的免疫功能。 機體免疫系統(tǒng)是一個復雜的系統(tǒng),包括特異性免疫和非特異性免疫，二者相輔相成，相互聯(lián)系，共同維持機體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定。免疫器官和免疫細胞及其產(chǎn)物（如抗體）是動物機體產(chǎn)生免疫應答的物質基礎。胸腺、法氏囊和脾臟作為禽類重要的中樞免疫免疫器官和外周免疫器官，其生長發(fā)育勢必與其免疫功能密切相關。一般免疫藥理學試驗常以藥物對免疫器官的增重作為衡量其免疫功能強弱的指標之一。[10]免疫器官指數(shù)能很好的反應機體的免疫器官的重量變化，且能將個體差異的影響降低到最低限度。[11]本實驗中，實驗組雞各免疫器官指數(shù)明顯高于對照組，提示清涼沖劑有促進免疫器官增重的作用，從而為機體免疫功能的增強提供物質基礎。 巨噬細胞是機體重要的免疫效應細胞,是機體抵抗病原體和腫瘤的第一道防線之一,在抗感染初期,吞噬和殺滅入侵微生物，發(fā)揮非特異性免疫作用。[12]在藥物對免疫功能的影響作用的研究中，巨噬細胞吞噬試驗是一個重要的非特異性免疫功能的觀察指標。在各種微生物和免疫學實驗指導中常用體內(nèi)吞噬細菌法來測定吞噬細胞的吞噬功能。本研究結果表明，實驗組的雞腹腔巨噬細胞吞噬功能增強，其吞噬百分率和吞噬指扮與對照組相比有顯著的差異（P<0.05），提示清涼沖劑可以提高機體的非特異性免疫能力。 ND抗體水平作為檢測特異性免疫能力的指標，在本研究中被列為研究對象之一。ND至今仍是影響?zhàn)B禽業(yè)經(jīng)濟效益的主要疫病之一。免疫程序混亂、免疫抑制以及免疫后血清保護性抗體不能快速提升，也是造成這兩種疫病廣為傳播的原因之一。[12]本研究中，整個實驗期間，實驗組抗體水平始終高于對照組，且在35日齡時，實驗組抗體水平與對照組差異極顯著（P<0.01），提示清涼沖劑在雞生長發(fā)育的不同階段對其特異性免疫起著連續(xù)的加強作用,使藥效作用時間更加持久。 綜上所述，以石膏為主要成分的復方清涼沖劑，可以明顯提高雞免疫器官指數(shù)、NDV抗體水平以及腹腔巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)，表明了清涼沖劑可以增強機體非特異性及特異性免疫功能。