中藥有效部位復(fù)方對(duì)小鼠熱應(yīng)激腸道T淋巴細(xì)胞增殖影響的組方機(jī)制研究

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中藥有效部位復(fù)方對(duì)小鼠熱應(yīng)激腸道T淋巴細(xì)胞增殖影響的組方機(jī)制研究 王自力　魏秀蓮　劉鳳華　毛帥　許劍琴 （1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，100094；2.北京市飼料獸藥監(jiān)察所　100107；3.北京市北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，北京 102206）

方劑是在中（獸）醫(yī)理論指導(dǎo)下，辨證論治的基礎(chǔ)上，根據(jù)動(dòng)物病情需要選擇適當(dāng)?shù)模▋晌换蚨辔叮┲兴?，酌定用量，按照一定的組成原則，配伍組合而成。藥物決定方劑的功效，方劑中藥味的增加或減少以及用量，可導(dǎo)致方劑配伍關(guān)系和功效變化。在中藥方劑及新藥研究中，雖可根據(jù)中獸醫(yī)理論和臨床經(jīng)驗(yàn)選擇藥物和組方，但中藥方劑多為復(fù)方且藥物劑量不一，即存在多因素多水平特點(diǎn)[1]，為中獸藥作用機(jī)理研究、中藥現(xiàn)代化和新藥開發(fā)及其產(chǎn)業(yè)化帶來(lái)很多困難。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是采用規(guī)格化的正交表，使試驗(yàn)因素和水平得到合理安排，并通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果分析各因素對(duì)試驗(yàn)觀察指標(biāo)的影響，分清各因素之間的主次關(guān)系和交互作用，確定各因素不同水平的最佳組合，是多因素多水平試驗(yàn)效率最高的設(shè)計(jì)方法。 　　熱應(yīng)激可引起動(dòng)物免疫機(jī)能下降，如引起小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖活性、IL-2濃度及其受體表達(dá)均出現(xiàn)下降[2]，誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞和脾臟細(xì)胞的凋亡，并引起動(dòng)物胸腺和脾臟萎縮[3]，還可通過(guò)下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)軸引起皮質(zhì)醇水平升高而影響動(dòng)物正常的生理和免疫功能[4~6]。因此，本試驗(yàn)在中獸醫(yī)方劑“君、臣、佐、使”組方原則的指導(dǎo)下，采用正交設(shè)計(jì)法研究藿香、蒼術(shù)、黃柏和石膏四種中藥有效部位不同組合以及不同水平對(duì)熱應(yīng)激后小鼠腸道淋巴細(xì)胞增殖的影響，旨在探討中藥有效部位復(fù)方組方機(jī)制。 　　1　材料與方法 　　1.1 藥品與試劑 　　中藥有效部位：石膏水提物（gypsum fibrosum water extract, GFWE）（硫酸鈣含量為92%）、黃柏生物堿（cortex phellodendri‘s alkaloid, CPA）（小檗堿含量為42.0%）、藿香揮發(fā)油包合物（herba agastachis‘s aetherolea, HAA）（百秋里醇含量30.47%）、蒼術(shù)揮發(fā)油包合物（rhizoma atractylodi’s aetherolea, RAA）（β-桉葉油醇含量33.63%）均由本課題組制備和定量測(cè)定，臨用前分別用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制成1mg/ml。 　　RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Hank’s干粉為Hyclone公司產(chǎn)品；小牛血清，購(gòu)自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；二硫蘇糖醇（DTT），購(gòu)自北京科昊澤生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞楓（DMSO），購(gòu)自Amresco公司；Ⅱ型膠原酶、EDTA、植物血凝素（PHA）購(gòu)自Sigma公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司。 　　1.2　試驗(yàn)方法 　　1.2.1　小鼠腸道淋巴細(xì)胞分離與培養(yǎng) 　　參照文獻(xiàn)方法[7,8]分離腸道淋巴細(xì)胞，即脫臼處死18~22g BALB/c鼠，置于75%酒精中浸泡5min，取出十二指腸到回盲腸結(jié)之間的腸道組織；用含有1000IU雙抗的Hank’s洗滌液反復(fù)沖洗；將腸道組織塊剪成1×1cm2大小置于含1000IU雙抗、5%小牛血清Hank’s洗滌液中浸泡5min，反復(fù)3次；加入20ml 37℃ EDTA-DTT消化液，間斷振蕩消化30min，收集消化液1000rpm離心5min以獲取淋巴細(xì)胞；向剩余組織塊中加入20ml 37℃的0.1%Ⅱ型膠原酶液，37℃恒溫振蕩水浴鍋中以250rpm振蕩消化40min；將剩余消化液經(jīng)2層無(wú)菌醫(yī)用紗布過(guò)濾；10000rpm離心濾液5min，收集細(xì)胞后用完全培養(yǎng)基洗滌2次；將兩次收集的淋巴細(xì)胞懸液緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液上層，以2000rpm離心20min，收集淋巴細(xì)胞分離液層和培養(yǎng)液中間的淋巴細(xì)胞層；用10%小牛血清RPMI-1640完全細(xì)胞培養(yǎng)基以1000rpm離心5min方式洗滌淋巴細(xì)胞2次，并經(jīng)玻璃纖維棉柱過(guò)濾；經(jīng)0.3%臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)算細(xì)胞活力＞90%后，用10%小牛血清完全培養(yǎng)基調(diào)整淋巴細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)/ml，按照0.5ml/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板后，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 　　1.2.2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，考察藿香揮發(fā)油、蒼術(shù)揮發(fā)油、黃柏生物堿和石膏水提物不同水平組方對(duì)熱應(yīng)激小鼠腸道淋巴細(xì)胞增殖的影響。即A，B，C，D，A×B，A×C，B×C，選用正交表L8（27）。因需考察A×B，就先將A放在第1列，B放在第2列由L8（27）交互作用列表查出A×B在第3列；將C放在第4列，同法查出A×C在第5列，B×C在第6列，D放在第7列。因素水平、表頭設(shè)計(jì)和試驗(yàn)方案見表1和表2。 　　表1因素和水平表 因素 factor 藿香 HAA 蒼術(shù) RAA 黃柏 CPA 石膏 GFWE 種類type A B C D 1 200mg/ml 200mg/ml 200mg/ml 100mg/ml 2 100mg/ml 100mg/ml 100mg/ml 50mg/ml 表2表頭設(shè)計(jì)和試驗(yàn)方案表 列array 1 2 3 4 5 6 7 因子 factors 藿香 HAA 蒼術(shù) RAA 藿香×蒼術(shù) HAA×RAA 黃柏 CPA 藿香×黃柏 HAA×CPA 蒼術(shù)×黃柏 RAA×CPA 石膏 GFWE 1 2 3 4 5 6 7 8 1（200） 1（200） 1（200） 1（200） 2（100） 2（100） 2（100） 2（100） 1（200） 1（200） 2（100） 2（100） 1（200） 1（200） 2（100） 2（100） 1 1 2 2 2 2 1 1 1（200） 2（100） 1（200） 2（100） 1（200） 2（100） 1（200） 2（100） 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 2 1 1 2 2 1 1（100） 2（50） 2（50） 1（100） 2（50） 1（100） 1（100） 2（50） 　　1.2.3 小鼠腸道淋巴細(xì)胞處理與數(shù)據(jù)處理 　　向分離獲得的小鼠腸道淋巴細(xì)胞懸液中加入不同濃度中藥有效部位組合復(fù)方以及1mg/ml PHA后，用10%小牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)基補(bǔ)足至1ml，將小鼠腸道淋巴細(xì)胞放于43℃熱應(yīng)激1h后于37℃、65%濕度條件下培養(yǎng)44h，加入10ml 5mg/ml的MTT液于37℃、65%濕度條件下培養(yǎng)4h，加入100ml DMSO混勻于570nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件按照正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行方差分析。 　　2.結(jié)果與分析 　　2.1 直觀分析 表3 中藥有效部位復(fù)方對(duì)熱應(yīng)激小鼠腸道淋巴細(xì)胞增殖的影響（直觀分析表） 藥物與交互作用 Medicine and interaction 藿香 HAA 蒼術(shù) RAA 藿香×蒼術(shù) HAA×RAA 黃柏 CPA 藿香×黃柏 HAA×CPA 蒼術(shù)×黃柏 RAA×CPA 石膏水提物 GFWE T細(xì)胞增殖 Proliferation of T lymphocyte 1 2 3 4 5 6 7 8 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2 2 2 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 2 1 2 1 1 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2 1 2 1 1 2 0.303 0.295 0.301 0.284 0.294 0.282 0.302 0.285 T1 T2 R 1.183 1.163 0.02 1.174 1.172 0.002 1.185 1.161 0.024 1.2 1.146 0.054 1.171 1.175 -0.004 1.166 1.18 -0.014 1.171 1.175 -0.004 2.346 　　據(jù)表3結(jié)果直觀分析可知，黃柏和藿香的極差大，故黃柏和藿香作為主藥，且分別以1水平，即200mg/ml對(duì)小鼠腸道T淋巴細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最大；蒼術(shù)和石膏為次要藥物，其水平分別選1水平，即分別為200mg/ml和100mg/ml。即最佳組方為A1B1C1D1，以中藥有效部位復(fù)方1對(duì)熱應(yīng)激小鼠腸道T淋巴細(xì)胞增殖影響最大。 　　2.2 方差分析 表4　中藥有效部位復(fù)方對(duì)熱應(yīng)激小鼠腸道T淋巴細(xì)胞增殖的影響 列號(hào) Array 1 2 3 4 5 6 7 藥物與交互 A B A×B C A×C B×C D Ri2 0.0004 0.000004 0.000576 0.002916 0.000016 0.000196 0.000016 SSi= Ri2/8 0.00005 0.0000005 0.000072 0.0003645 0.000002 0.0000245 0.000002 　　注：表中為Ri2各種藥物極差的平方，SSi公式中8為復(fù)方總數(shù)。 　　各處理因素自由度（df）＝水平數(shù)－1 　　各因素的均方（MS）＝SS/df 　　計(jì)算誤差列離均差平方和（SSe）、自由度（dfe）和均方（MSe），公式同上。即SSe＝?SS（SS2＋SS5+SS7）；dfe＝1+1+1＝32；MSe＝SSe/3＝0.0000015 　　F檢驗(yàn)。F＝MS/MSe 　　結(jié)果判斷：可查F值表。如F<F0.05，P>0.01，差別無(wú)顯著；F>F0.05，P<0.05，差異顯著；F>F0.01，P<0.01，差異極顯著。 　　選擇離差平方和較小的SS2、SS5和SS7作為誤差，計(jì)算各因子F值，并對(duì)藥物的2個(gè)水平的作用評(píng)定，分析最佳交互列作用，以找出最佳劑量的最佳配伍。 　　表5 中藥有效部位復(fù)方對(duì)熱應(yīng)激小鼠腸道T淋巴細(xì)胞增殖影響方差分析表 變異來(lái)源 SS df MS F P F0.05(1, 3) F0.01(1, 3) A B A×B C A×C B×C D 0.00005 0.0000005 0.000072 0.0003645 0.000002 0.0000245 0.000002 1 1 1 1 1 1 1 0.00005 0.000072 0.0003645 0.0000245 33.33 48.00 243.00 16.33 <0.05 <0.01 <0.01 <0.05 10.1 34.1 誤差 SS2+SS5+SS7＝0.0000045 3 0.0000015 　　表6　藿香和蒼術(shù)（A×B）對(duì)熱應(yīng)激小鼠腸道T淋巴細(xì)胞增殖的交互作用分析 A1（藿香200mg/ml） A1(HAA 200mg/ml) A2（藿香100mg/ml） A2(HAA 100mg/ml) B1（蒼術(shù)200mg/ml） B1 (RAA200mg/ml) 0.303+0.295=0.598 0.294+0.282=0.576 B2（蒼術(shù)100mg/ml） B2 (RAA100mg/ml) 0.301+0.284=0.585 0.302+0.285=0.587 　　由表5可知，對(duì)熱應(yīng)激小鼠腸道T淋巴細(xì)胞增殖影響較大的藥物有效部位是黃柏生物堿及藿香揮發(fā)油（F值分別為243.00和33.33）。交互作用較好的交互列依次為：A×B（藿香和蒼術(shù)）和B×C（蒼術(shù)和黃柏）。由表6可知，蒼術(shù)揮發(fā)油和藿香揮發(fā)油的濃度增加，對(duì)熱應(yīng)激后小鼠腸道T淋巴細(xì)胞增殖具有較大影響，以藿香揮發(fā)油濃度增加效果尤為明顯。 　　綜合直觀分析、方差分析和交互作用分析，即認(rèn)為藿香、蒼術(shù)、黃柏和石膏四味中藥有效部位復(fù)方對(duì)熱應(yīng)激后小鼠腸道T淋巴細(xì)胞增的最優(yōu)組合為A1B1C1D1，即藿香揮發(fā)油200mg/ml、黃柏200mg/ml、蒼術(shù)揮發(fā)油200mg/ml、石膏水提物100mg/ml。 　　3　討論 　　腸道黏膜免疫系統(tǒng)包括三種淋巴細(xì)胞：分布于腸道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)的淋巴細(xì)胞，即上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（IEL）、固有層淋巴細(xì)胞（LPL）、集合淋巴結(jié)（PP結(jié)）淋巴細(xì)胞，構(gòu)成腸道黏膜免疫主要部分，其功能的正常對(duì)于維護(hù)腸道黏膜免疫功能具有重要作用；夏季高溫氣候易引起動(dòng)物產(chǎn)生熱應(yīng)激，導(dǎo)致其免疫力下降而給畜牧生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失[2～6]。根據(jù)中獸醫(yī)理論，我國(guó)大部分養(yǎng)豬場(chǎng)夏季環(huán)境多屬于高溫高濕環(huán)境，常被認(rèn)為是濕熱之邪。夏季動(dòng)物產(chǎn)生熱應(yīng)激與飼養(yǎng)環(huán)境因素有關(guān)，即感受濕熱病邪。濕熱病邪常從上焦而入，也可直中中焦，后入下焦，由表及里；濕熱之邪常郁阻中焦脾胃，導(dǎo)致中焦脾胃運(yùn)化功能障礙，且濕為陰邪，熱為陽(yáng)邪，二者屬性不一，故病程中出現(xiàn)濕偏重、熱偏重或者濕熱并重等類型。因此，在防治中常采用清熱祛濕原則。本試驗(yàn)中擬方為藿香、黃柏、蒼術(shù)、石膏四味藥組成，主功效為清熱瀉火、解表和中、燥濕健脾，用于動(dòng)物在夏季高溫高濕環(huán)境感受濕熱之邪后出現(xiàn)的濕熱證。方中藿香芳香化濁，開胃止嘔，發(fā)表解暑及醒脾理濕；黃柏苦寒，入腎、膀胱經(jīng)和大腸經(jīng)，主瀉下焦火，具有清濕熱、瀉火解毒功效，使?jié)駸嵯滦梗c藿香共為方中主藥。蒼術(shù)燥濕以健脾，祛風(fēng)濕，臣藥；石膏辛甘大寒，具有清泄氣分實(shí)熱，為佐使藥。 　　目前對(duì)中藥復(fù)方的藥理研究方法可分為全方研究和拆方研究。全方有助于藥效學(xué)研究，但不利于研究中藥復(fù)方的組方規(guī)律；拆方研究可說(shuō)明中藥復(fù)方的配伍關(guān)系和組方理論，主要通過(guò)正交試驗(yàn)法和拆方分析法[9]進(jìn)行。本試驗(yàn)中采用的正交試驗(yàn)法是按照一定的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表將一個(gè)方劑中的藥物（因素）和劑量（水平）按照一定規(guī)律設(shè)置，遵循這種規(guī)律性設(shè)計(jì)，以最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)得出盡可能最佳的試驗(yàn)結(jié)果；試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)直觀分析、方差分析和交互分析確定藿香、蒼術(shù)、黃柏和石膏有效部位組成復(fù)方的最優(yōu)組合是A1B1C1D1，即藿香揮發(fā)油200mg/ml、黃柏生物堿200mg/ml、蒼術(shù)揮發(fā)油200mg/ml、石膏水提物100mg/ml；對(duì)熱應(yīng)激小鼠腸道T、B淋巴細(xì)胞增殖交互作用較好的是藿香揮發(fā)油和蒼術(shù)揮發(fā)油，且以蒼術(shù)揮發(fā)油劑量增加則效果較好；且以黃柏生物堿對(duì)熱應(yīng)激小鼠腸道T、B淋巴細(xì)胞增殖影響最大，藿香揮發(fā)油影響居其次，二者共為方中主藥，而蒼術(shù)揮發(fā)油和石膏水提物對(duì)T、B淋巴細(xì)胞增殖影響較小，作為臣、佐藥，與中獸醫(yī)對(duì)熱應(yīng)激的辨證論治結(jié)果一致；以藿香揮發(fā)油和蒼術(shù)揮發(fā)油交互效果最好，且以蒼術(shù)揮發(fā)油劑量增加則效果較好，說(shuō)明中藥有效部位劑量在組方中的劑量效應(yīng)的重要性，同時(shí)也說(shuō)明了中藥有效部位具有中藥特性，且其復(fù)方可顯著促進(jìn)熱應(yīng)激小鼠腸道T淋巴細(xì)胞增殖。 　　根據(jù)正交法設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，其試驗(yàn)點(diǎn)均衡分布，代表性強(qiáng)，可以最大限度節(jié)約人力、物力、時(shí)間，同時(shí)可以避免完全設(shè)計(jì)方法的盲目性，且試驗(yàn)結(jié)果分析具有計(jì)算簡(jiǎn)單和結(jié)論可靠的特點(diǎn)[10]。對(duì)于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素選擇必須在專業(yè)知識(shí)（中獸醫(yī)理論）指導(dǎo)下進(jìn)行篩選，使其具有可控性和獨(dú)立性，水平的選擇應(yīng)該具備合理性，符合專業(yè)理論知識(shí)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的要求，否則易導(dǎo)致無(wú)效結(jié)果出現(xiàn)[11，12]。因此，根據(jù)中獸醫(yī)辨證和方劑理論，及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法確定不同組成中藥有效部位復(fù)方，利用熱應(yīng)激引起腸道淋巴細(xì)胞增殖抑制模型，篩選確定中藥有效部位復(fù)方組成和劑量，可作為探討中藥方劑組方機(jī)制和中藥方劑現(xiàn)代開發(fā)一條重要途徑。

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中醫(yī)治病慢,這是個(gè)大問(wèn)題