注射用雙連翹對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和抵抗病毒感染的影響

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注射用雙連翹對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和抵抗病毒感染的影響 張國(guó)紅　杜國(guó)清　汪勇　熊劍 （四川華西動(dòng)物藥品研究所，綿陽(yáng)高新區(qū)，621000） 何曉媛　　蘇志華　　王蓉 （四川華西動(dòng)物藥業(yè)有限公司，綿陽(yáng)梓潼，622150）

摘要：將5種濃度的注射用雙連翹分別加入到12h前接種新城疫病毒的雞胚成纖維（CEF）細(xì)胞單層中，于病毒接種后72h用中性紅染料吸收法測(cè)定CEF細(xì)胞的活性，以評(píng)價(jià)不同濃度注射用雙連翹對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和抗病毒感染的影響。結(jié)果表明，注射用雙連翹有較強(qiáng)的抑制病毒感染作用和微弱的促細(xì)胞生長(zhǎng)作用，基本與濃度呈正相關(guān)。 關(guān)鍵詞：注射用雙連翹；雞胚成纖維細(xì)胞；新城疫病毒。     注射用雙連翹是由板藍(lán)根、金銀花、連翹等三味中藥按一定比例經(jīng)系統(tǒng)工藝制備而成的獸用粉針劑。本研究觀察了注射用雙連翹對(duì)CEF細(xì)胞生長(zhǎng)及其抗新城疫病毒感染的影響，旨在探討注射用雙連翹的藥理作用，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 1、材料與方法 1·1試驗(yàn)藥品     注射用雙連翹，主要成分為板藍(lán)根、金銀花、連翹等按一定比例經(jīng)系統(tǒng)工藝配制而成，由四川華西動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供。根據(jù)對(duì)CEF細(xì)胞安全濃度的測(cè)定結(jié)果[1]，用細(xì)胞維持液分別稀釋成高、次高、中、次低、低5種濃度（見結(jié)果中各表，均以凈含量表示），常規(guī)消毒后備用。 1·2病毒     新城疫IV系疫苗病毒（NDV，LaSota），四川綿陽(yáng)寶萊生物藥業(yè)有限公司提供。經(jīng)9日齡SPF雞胚傳代2次，按Reed-Muench法測(cè)定CEF細(xì)胞半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50），用細(xì)胞維持液配成100 TCID50濃度備用。 1·3主要試劑     MEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品。按說(shuō)明書配制，加入犢牛血清，5%為細(xì)胞生長(zhǎng)液、2%為細(xì)胞維持液，再常規(guī)量加入谷酰胺和雙抗。胰蛋白酶，用PBS溶液配制成0.25%的濃度，調(diào)節(jié)PH值至7.4，0.22um混合纖維素酯微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。中性紅，上海試劑三廠生產(chǎn)，用153mmol/L的NaCL溶液配制成含中性紅0.5mg/ml的溶液。 1·4試驗(yàn)方法     按文獻(xiàn)[2]方法制備CEF細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至5×105個(gè)/ml，后加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100ul；37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)36h、CEF細(xì)胞已長(zhǎng)成致密單層后，倒掉孔內(nèi)液體，用維持液洗3次，最后倒掉維持液，開始分組和處理。 一塊細(xì)胞板，設(shè)立病毒-注射用雙連翹組和注射用雙連翹組各20孔（5種濃度×4孔/濃度），另設(shè)病毒對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組各4孔和無(wú)細(xì)胞孔1孔（只加營(yíng)養(yǎng)液，作為測(cè)定時(shí)空白調(diào)零孔）。首先在病毒-注射用雙連翹組和病毒對(duì)照組每孔加入100TCID50病毒液100ul，其它組加入100ul細(xì)胞維持液，培養(yǎng)12小時(shí)后倒掉孔內(nèi)液體。病毒-注射用雙連翹組和注射用雙連翹組每孔加入100ul細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。于病毒接種72h后測(cè)定CEF細(xì)胞活性。 1.5CEF細(xì)胞活性測(cè)定     采用中性紅染料吸收法[3]。測(cè)定前2h每孔加入50uL中性紅活染液；測(cè)定時(shí)倒掉孔內(nèi)液體，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每孔加入200uL脫色液，置微孔板振蕩器振蕩10min；然后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定570nm下的吸光（OD）值，作為細(xì)胞活性的指標(biāo)。 分別統(tǒng)計(jì)比較病毒－注射用雙連翹組與病毒對(duì)照組和同濃度注射用雙連翹組、注射用雙連翹組和細(xì)胞對(duì)照組OD值的差異性，以評(píng)價(jià)注射用雙連翹對(duì)病毒感染細(xì)胞能力和CEF細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 2  結(jié)果與分析     注射用雙連翹的測(cè)定結(jié)果見下表。病毒－注射用雙連翹組OD值均大于、中濃度組顯著大于、高、次高和次低濃度組極顯著大于病毒對(duì)照組（P﹤0.01），除次高濃度組外其他各組與同濃度中藥組差異均不顯著；注射用雙連翹組除低濃度組外均大于細(xì)胞對(duì)照組。說(shuō)明注射用雙連翹有較強(qiáng)的抑制病毒感染作用和微弱的促細(xì)胞生長(zhǎng)作用，基本與濃度呈正相關(guān)。 注射用雙連翹的測(cè)定結(jié)果 濃度/ug.mL-1 病毒－注射用雙連翹組 注射用雙連翹組 300 0.383±0.006a 0.383±0.061a 150 0.390±0.028a* 0.378±0.029a 120 0.350±0.046a 0.375±0.037a 80 0.378±0.079a 0.365±0.029a 40 0.335±0.060ba 0.343±0.019a 病毒對(duì)照 0.276±0.054b 細(xì)胞對(duì)照 0.363±0.027a 注：同列數(shù)據(jù)標(biāo)不同字母者表示差異顯著或極顯著（P<0.05或P<0.01）；*表示注射用雙連翹-病毒組與相應(yīng)注射用雙連翹組相比差異顯著（P<0.05）。 3  小結(jié)與討論 3.1 注射用雙連翹對(duì)單層CEF生長(zhǎng)有不同的影響     中性紅染料吸收法的原理是活細(xì)胞能夠吸收中性紅。中性紅是一種弱陽(yáng)離子染料，能與活細(xì)胞漿中的陰離子結(jié)合而濃縮于活細(xì)胞中，并不被細(xì)胞洗滌液洗脫，滲入活細(xì)胞的中性紅量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。因此OD值直接反映活細(xì)胞的數(shù)量，與細(xì)胞增殖的程度成正比[3]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射用雙連翹組的OD值有的稍大于、有的稍小于細(xì)胞對(duì)照組，表明注射用雙連翹對(duì)單層CEF生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。 3.2 注射用雙連翹顯著抑制病毒感染     OD值與細(xì)胞的病變程度成反比，間接地反映病毒感染細(xì)胞的程度。當(dāng)細(xì)胞被病毒感染破壞或被干擾了功能以后，可降低對(duì)中性紅的吸收能力，隨著病毒愛細(xì)胞內(nèi)不斷生長(zhǎng)，細(xì)胞受到損壞，病變程度逐漸加重，受損細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，OD值降低[4]。結(jié)果顯示，注射用雙連翹5個(gè)濃度病毒－注射用雙連翹組的OD值顯著大于病毒對(duì)照組。表明注射用雙連翹有較強(qiáng)的抑制病毒感染作用。     中藥成分既可通過(guò)直接殺滅病毒來(lái)保護(hù)細(xì)胞，也可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)抑制病毒的感染。注射用雙連翹主要表現(xiàn)抑制病毒感染作用，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。 在量效方面，注射用雙連翹的作用與劑量呈正相關(guān)，濃度越高抑制病毒感染作用越強(qiáng)。這些說(shuō)明注射用雙連翹必須有合適的劑量才能發(fā)揮最佳效應(yīng)。