小檗堿、黃芩苷對小鼠2-細(xì)胞胚胎體外培養(yǎng)效果的初步研究

貔貅

摘要：試驗以添加抗菌素的mCZB液為對照組，分別篩選比較了小檗堿、黃芩苷二種中藥成分對小鼠2-細(xì)胞胚胎體外培養(yǎng)效果的影響。結(jié)果表明：小檗堿和黃芩苷(berberine and baicalin) 最佳濃度分別為0.10μg/ml和4μg/ml，其120h孵化胚胎發(fā)育率分別為89.9%和64.1%，與對照組比較差異極顯著(50.7%) (P < 0.01)和顯著(47.8%) (P < 0.05)。說明小檗堿、黃芩苷能有效促進2-細(xì)胞胚胎體外生長發(fā)育。
關(guān)鍵詞：小檗堿，黃芩苷，2-細(xì)胞胚胎，體外培養(yǎng)，小鼠
中圖分類號：S814.8文章標(biāo)識碼：A

Initial Study on Effect of Berberine and Baicalin on 2-cell

Embryos in vitroCulture in Mice
Abstract In this experiment，mCZB medium added in penicillin and dihydrostreptomycin was used as control group, the effect of the Chinese medicines component Berberine and Baicalin on 2-cell embryos in vitro culture from the mice were compared respectively. The results showed that the optimal level of Berberine and Baicalin were 0.10μg/ml and 4μg/ml, the development ratio of hatched blastocyst were 89.9% and 64.1% respectively at 120h, there weresignificantly difference (50.7%) (P < 0.01) and differently (47.8%) (P < 0.05) compared with control group.The results indicated that Berberine and Baicalin could accelerated development of 2-cell embryos in vitro.
Key words：berberine, baicalin , 2-cell embryos , in vitro culture , mice

    體外受精、胚胎分割、動物克隆、胚胎嵌合、胚胎干細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動物等胚胎生物技術(shù)的應(yīng)用，都需借助于胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)。適宜的體外培養(yǎng)系統(tǒng)是獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的基礎(chǔ)條件和有效工具。目前，體外培養(yǎng)的胚胎囊胚發(fā)育率較低，有相當(dāng)比例的胚胎在培養(yǎng)過程中凋亡，嚴(yán)重影響了胚胎產(chǎn)業(yè)化進程，因此，探討改進胚胎體外培養(yǎng)體系十分必要。
    體外培養(yǎng)的基本條件之一是無菌操作，為了防止因操作不嚴(yán)格而造成的污染，培養(yǎng)液內(nèi)一般常常加入一定的抗菌素，最常用的是青霉素和鏈霉素，而抗菌素對體外胚胎的生長發(fā)育是否有不良影響，還有待探討；體外培養(yǎng)條件下的胚胎，其代謝會產(chǎn)生一定的自由基，高氧濃度的自由基對胚胎產(chǎn)生毒性[1]，如過氧化氫、過氧化物陰離子、氫氧根離子等影響胚胎的正常卵裂和進一步發(fā)育。目前的研究表明，中草藥中的某些有效成份對細(xì)胞的增殖有促進作用[2]，而且具有一定的抗氧化作用[3]和激素作用[4]等，而將中藥成分添加到培養(yǎng)基中對胚胎進行體外培養(yǎng)國內(nèi)外報道甚少。鑒于中藥有效成分多靶點、全方位的藥理作用特點，基于邸冉，高建明（2004)[5]將中藥成分添加到培養(yǎng)基中對小鼠胚胎體外培養(yǎng)的初步研究結(jié)果，本試驗以小鼠2-細(xì)胞胚胎為材料，在培養(yǎng)液中直接添加小檗堿、黃芩苷中藥成分，比較其對胚胎體外發(fā)育的影響，并篩選其最佳濃度，旨在初步建立適宜胚胎體外發(fā)育的添加中藥成份的培養(yǎng)體系，從而期望提高胚胎體外發(fā)育率和胚胎質(zhì)量，為今后進一步克服胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)存在的缺陷開辟一條新的途徑。
材料與方法
1.1 試驗動物
    試驗小鼠為8～10周齡ICR系SPF性成熟小鼠(購自北京試驗動物中心)。雌鼠體重29～32g，雄鼠體重33～35g，雌雄分籠飼養(yǎng)在室溫、自然光照、自由飲水的條件下，采用全價繁殖顆粒飼料飼養(yǎng)。經(jīng)一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按常規(guī)方法對雌鼠進行超數(shù)排卵處理。
1.22-細(xì)胞胚胎獲取
    根據(jù)小鼠陰部變化選擇動情間期和動情前期雌性小鼠[6]于19:00腹腔注射PMSG（批號：20040403，天津試驗動物中心）10IU/只，48h后腹腔注射hCG（批號：20031012，寧波市激素制藥廠）10IU/只，注射hCG后即與公鼠按1:1合籠。次日8:00檢查陰道栓，見陰栓者于注射hCG 47h后以頸部脫臼法處死雌鼠，取出輸卵管和卵巢，置于37 oC mPBS沖卵液中，在體視顯微鏡下分離脂肪和系膜，用4號針頭連接2 ml注射器撕開輸卵管壺腹部獲得2-細(xì)胞胚胎。選擇形態(tài)正常、卵裂球均一、透明帶完整的胚胎轉(zhuǎn)入mCZB基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌3次，然后均勻分布到各試驗組培養(yǎng)液中洗滌2次后入微滴進行培養(yǎng)。
1.3試驗設(shè)計
    以mCZB為基礎(chǔ)培養(yǎng)液。初步選出黃連有效成分小檗堿(Berberine，BR；天津藥物研究院)、黃芩有效成分黃芩苷(Baicalin，Bai；天津藥物研究院))作為添加的中藥成分來篩選其對早期胚胎體外發(fā)育的影響。共設(shè)計2個試驗，分別篩選其適宜濃度（表1）。

表1 試驗組別設(shè)計

試驗 設(shè)計	對照組		試驗1組	試驗2組	試驗3組	試驗4組	試驗5組
	基礎(chǔ)液	添加雙抗
試驗1	mCZB	青霉素(0.06mg/ml)+鏈霉素(0.07mg/ml)	mCZB +BR (0.08μg/ml)	mCZB +BR (0.09μg/ml)	mCZB +BR (0.10μg/ml)	mCZB +BR (0.11μg/ml)	mCZB +BR (0.12μg/ml)
試驗2	mCZB	青霉素(0.06mg/ml)+鏈霉素(0.07mg/ml)	mCZB +Bai (2μg/ml)	mCZB +Bai (3μg/ml)	mCZB +Bai (4μg/ml)	mCZB +Bai (5μg/ml)	mCZB +Bai (6μg/ml)

1.4 胚胎培養(yǎng)
    在培養(yǎng)皿中按不同試驗組別制備50ml的培養(yǎng)液小滴，覆以礦物油，置入5%CO2、95%空氣、37℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中平衡2h以上。然后將已洗滌好的胚胎，用移卵管吸入到平衡好的培養(yǎng)小滴中，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個微滴中移入10枚左右的胚胎。入胚后15-h換加葡萄糖mCZB培養(yǎng)液，以后每間隔48h換液一次，分別于入培后48h、72h、96h、120h檢查胚胎發(fā)育狀況。

1.5小鼠胚胎發(fā)育時期判定
    本試驗不同培養(yǎng)時間胚胎發(fā)育形態(tài)見表2。

表2胚胎形態(tài)學(xué)判定[7]

發(fā)育時期	形態(tài)特征
桑椹胚(M)	卵裂球隱約可見，細(xì)胞團的的體積幾乎占滿卵周隙.
致密桑椹(CM)	卵裂球在桑椹的基礎(chǔ)上進一步分裂變小，看不清楚卵裂球的界線，細(xì)胞團收縮至卵周間隙的60%～70%。
早期囊胚(EB)	出現(xiàn)透明的囊胚腔，但難以區(qū)分清內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)層，細(xì)胞團占卵周間隙的70%～80%。
囊胚(B)	囊胚腔增大明顯，內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)層細(xì)胞界線清晰，細(xì)胞充滿了卵周間隙。
擴張囊胚(XB)	囊胚腔充分?jǐn)U張，體積增至原來的1.2～1.5倍，透明帶變薄，相當(dāng)于厚度的1/3。
孵化囊胚(HB)	透明帶破裂，內(nèi)細(xì)胞團脫出透明帶。

1.6 數(shù)據(jù)處理
    采用DPS專業(yè)版統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行卡方獨立性檢驗。

2 結(jié) 果
2.1小檗堿對小鼠2-細(xì)胞胚胎體外培養(yǎng)效果的影響
    經(jīng)8個批次，538枚胚胎的體外培養(yǎng)后，初步篩選出小檗堿5個濃度組，再進一步篩選其最佳濃度。觀察對照組與試驗組對胚胎體外生長發(fā)育的影響（見表3）。

表3小檗堿對小鼠2-細(xì)胞胚胎發(fā)育的影響

試驗1	批次	入培胚胎數(shù)量/枚	48h	72h	96h	120h
			(M/入培數(shù)) M%	(B/入培數(shù)) B%	(XB/入培數(shù))數(shù))XB%	(HB/入培數(shù)) HB%
對照組	9	73	(73/73) 100a	(64/73) 87.6a	(53/73) 72.6a	(37/73) 50.7Aa
試驗 1組	8	74	(72/74) 97.3a	(71/74) 95.9a	(67/74) 90.1b	(58/74) 78.3Bb
試驗 2組	8	105	(104/105) 99.0a	(102/105) 97.1a	(99/105) 94.2b	(93/105) 88.6Bc
試驗 3組	8	99	(97/99) 98.0a	(96/99) 97.0a	(96/99) 97.0b	(93/99) 89.9Bc
試驗 4組	9	97	(95/97) 97.9a	(89/97) 91.8a	(85/97) 87.6b	(81/97) 83.5Bc
試驗 5組	8	72	(67/72) 93.1a	(65/72) 90.2a	(62/72) 86.1b	(51/72) 70.8Bb

注：同一豎欄肩注不同大寫字母之間表示差異極顯著（P < 0.01），不同小寫字母之間表示差異顯著（P < 0.05），相同字母之間表示差異不顯著（P > 0.05）。
    由表3可見，體外培養(yǎng)48h、72h，2-細(xì)胞胚胎發(fā)育至桑椹胚和囊胚發(fā)育率，對照組和試驗各組間及試驗組之間均無顯著差異(P > 0.05)。體外培養(yǎng)96h，試驗各組擴張囊胚發(fā)育率均顯著好于對照組(72.6%) (P < 0.05)，各試驗組間無顯著差異(P > 0.05)，其中以試驗3組發(fā)育率最高(97.0%)；試驗各組120h孵化胚胎發(fā)育率極顯著高于對照組（50.7%）(P < 0.01)，試驗組間以試驗2、3、4組孵化胚胎發(fā)育率顯著高于試驗1、5組(P < 0.05)，其中以試驗3組發(fā)育率最好(89.9%)。

2.2黃芩苷對小鼠2-細(xì)胞胚胎體外培養(yǎng)效果的影響
    經(jīng)5個批次，221枚胚胎的體外培養(yǎng)初步篩選后，選出黃芩苷5個濃度組再進一步篩選其最佳濃度。觀察對照組與試驗組對胚胎體外生長發(fā)育的影響（見表4）。

試驗2	批次	入培胚胎數(shù)量/枚	48h	72h	96h	120h
			(M/入培數(shù)) M%	(B/入培數(shù)) B%	(XB/入培數(shù)) XB%	(HB/入培數(shù)) HB%
對照組	8	90	(85/90) 94.4a	(72/90) 80.0b	(64/90) 71.1b	(43/90) 47.8a
試驗 1組	8	90	(81/90) 90.0a	(71/90) 78.9b	(55/90) 61.1b	(43/90) 47.8a
試驗 2組	8	84	(71/84) 84.5a	(72/84) 85.7b	(55/84) 65.5b	(48/84) 57.1b
試驗 3組	7	78	(72/78) 92.3a	(66/78) 84.6b	(62/78) 79.5b	(50/78) 64.1b
試驗 4組	8	89	(88/89) 98.9a	(77/89) 86.5b	(67/89) 75.3b	(51/89) 57.3b
試驗 5組	6	70	(61/70) 87.1a	(57/70) 81.4b	(49/70) 70.0b	(32/70) 45.7a

表4黃芩苷對小鼠2-細(xì)胞胚胎發(fā)育的影響

注：同一豎欄肩注不同大寫字母之間表示差異極顯著（P < 0.01），不同小寫字母之間表示差異顯著（P < 0.05），相同字母之間表示差異不顯著（P > 0.05）。

    由表4可見，體外培養(yǎng)2-細(xì)胞胚胎48h、72h、96h，對照組和各試驗組及試驗組間胚胎發(fā)育率均無顯著差異(P > 0.05)；體外培養(yǎng)120h，試驗2組(57.1%)、試驗3組(64.1%)、試驗4組(57.3%)孵化胚胎發(fā)育率顯著高于對照組(47.8%)(P < 0.05)，試驗組間以試驗2、3、4組孵化胚胎發(fā)育率顯著高于試驗1、5組(P < 0.05)，其中試驗3組孵化胚胎發(fā)育率最高(64.1%)。

3 討 論
    本試驗結(jié)果表明小檗堿和黃芩苷二種中藥成分，以小檗堿對胚胎體外培養(yǎng)發(fā)育的效果最好。其體外培養(yǎng)的最佳濃度組和孵化胚胎發(fā)育率，小檗堿最佳濃度為0.10μg/ml，孵化胚胎發(fā)育率89.9%；黃芩苷最佳濃度為4μg/ml，孵化胚胎發(fā)育率64.1%。而二個試驗中對照組孵化胚胎的發(fā)育率分別為50.7%、47.8%。對比試驗結(jié)果可見，中藥成分小檗堿和黃芩苷對胚胎體外生長發(fā)育發(fā)育起到了積極的促進作用。白照岱等(2004)[8-9]在CZB中添加不同濃度的胰島素和葡萄糖，以及添加不同濃度的表皮生長因子對小鼠2-細(xì)胞胚胎體外培養(yǎng)孵化囊胚發(fā)育率分別為25.3%和21.2%?？梢姡驹囼炛兴幊煞謱ε咛グl(fā)育的促進作用非常顯著。
    小檗堿是黃連中的主要有效成分，是一種苯并異喹啉類季銨型生物堿。長期以來對其生化、藥理、臨床的研究，證明它是一種沒有細(xì)胞毒和致突變作用、具有廣泛用途的藥物[10]。大量研究表明小檗堿具有廣譜的體外抗菌效果，其低濃度可以抑菌，高濃度可以殺菌，另報道小檗堿抗痢疾桿菌作用強度與磺胺相近，但其作用不受血清的影響，另一方面小檗堿的抗藥菌株產(chǎn)生較多，且無交叉感染[11]。黃芩苷的抗微生物的作用已早為醫(yī)學(xué)界所認(rèn)識，其清熱解毒作用的實質(zhì)就是對細(xì)菌和病毒等致病原的抑制或殺滅作用。本試驗中，二種中藥成分各試驗組中均未添加抗菌素，可能與其抑菌作用有一定關(guān)系。
    CAMP和cGMP與細(xì)胞的增殖、分化和代謝密切相關(guān)。cAMP有促進細(xì)胞分化的作用，cGMP則具有促進細(xì)胞分裂的作用。Manejwala等(1986)[12]研究證明用cAMP類似物培養(yǎng)早期胚胎,能促進囊胚腔的擴張。Hui等(1991)[13]在人血小板體外試驗證明小檗堿可使cAMP升高，亦可抑制其升高，視不同條件而定。推測小檗堿可能對胚胎cAMP和cGMP有積極的作用。生理水平的NO作為信號分子可以對早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用也需要通過cGMP實現(xiàn)[14-15]，而NO是一種自由基性質(zhì)的氣體，分子量小，化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單，由于其含有一個未成對電子，故有很大的生物活性，它可以自由穿過生物膜，作用于細(xì)胞內(nèi)的靶分子，作為第二信使而發(fā)揮信息傳遞的功能，并以相對特異的方式控制多種細(xì)胞的功能或生理作用，在受到各種刺激因素，如外來抗原、細(xì)菌內(nèi)毒素、或細(xì)胞因子等誘導(dǎo)活化時，誘導(dǎo)NOS（iNOS）可生成大量的有持續(xù)活性的NO，參與免疫系統(tǒng)的非特異性防御功能。NO在免疫與炎癥反應(yīng)中的細(xì)胞毒作用也可損傷正常的組織，導(dǎo)致NO的保護與損傷雙重作用[16-17]。NO生成過多且時間過長，可能導(dǎo)致多種病理改變，反之，若NO合成不足又會使NO的生理功能得不到正常的發(fā)揮，所以說NO具有兩面性，是“雙刃刀”。Ko等(2000)[18]通過離體大鼠腸系膜動脈研究報道，小檗堿是通過作用于血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞兩種途徑而產(chǎn)生血管松馳作用的。血管內(nèi)皮釋放NO是小檗堿產(chǎn)生血管松弛作用的內(nèi)皮依賴性機制，說明小檗堿與細(xì)胞分泌NO的作用相關(guān)。本試驗中，小檗堿極顯著的促進了胚胎的生長發(fā)育，是否與直接或間接對胚胎發(fā)育的微環(huán)境起到調(diào)節(jié)作用還有待進一步研究。
    胚胎代謝所產(chǎn)生的自由基，如過氧化氫、過氧化物陰離子及氫氧根離子等影響胚胎的正常卵裂。囊胚對過氧化脂質(zhì)導(dǎo)致的損傷十分敏感[19]。正常小鼠卵母細(xì)胞中的H2O2水平較低，1-至8-細(xì)胞期的H2O2水平略高于以后各期胚胎的水平。但當(dāng)在體外培養(yǎng)1-細(xì)胞或2-細(xì)胞胚胎時，到2-細(xì)胞中期時的H2O2水平已經(jīng)很高，而且一直到整個4-細(xì)胞期均居高不下[20]，這種水平的H2O2水平恰好發(fā)生在胚胎基因的激活時期。而黃芩苷在清除自由基作用效果明顯。有研究表明黃芩苷對羥自由基、超氧陰離子自由基、烷過氧自由基等有較強的清除作用；對過氧化脂質(zhì)生成的抑制作用也很明顯[21-23]。這可能是本試驗中添加黃芩苷最佳濃度組結(jié)果優(yōu)于對照組的原因。
    小檗堿、黃芩苷對2-胚胎細(xì)胞發(fā)育的促進作用通過本試驗可以明顯看出是客觀存在的，其作用機理還有待今后進一步的研究探討。