白頭翁素對LT致腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO升高的影響

貔貅

摘要：為了探討白頭翁在治療細菌性痢疾方面的藥理機制，通過體外培養(yǎng)腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞，采用硝酸還原酶法檢測各試驗組細胞上清液中NO含量，研究了白頭翁素對正常培養(yǎng)的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞和LT刺激后的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO的影響。研究結(jié)果顯示白頭翁素對正常腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO無明顯影響，但可顯著抑制LT引起的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO升高。表明白頭翁素抑制LT刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO，是白頭翁素的重要藥理機制。
關(guān)鍵詞：微血管內(nèi)皮細胞；腸黏膜；LT；白頭翁素；NO
    白頭翁作為治療菌痢的要藥，其主要成分是白頭翁素。目前，對白頭翁素藥理機制的研究并不多見，一般認為主要在于抑菌[1]，對于其它的藥理作用尚不得而知。越來越多的研究表明，細菌毒素是引起腹瀉的罪魁禍?zhǔn)?，而細菌毒素作用的主要靶細胞是腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞[2]。因此，阻斷細菌毒素對腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞的損傷，為抗細菌病藥物的研究提供了新的思路和方法。熱敏腸毒素（LT）是產(chǎn)毒素性大腸桿菌釋放的主要毒素，可直接導(dǎo)致腹瀉。本試驗在建立LT引起腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO升高病理模型的基礎(chǔ)上，研究了白頭翁素對其影響，以進一步闡明白頭翁素的抗腹瀉機制。
1材料與方法
1.1主要材料與試劑
腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞：本實驗室培養(yǎng)的第八代大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞[3]。
完全培養(yǎng)基：在DMEM培養(yǎng)液中按比例加入以下成份：15% FBS（Hyclone）、0.584mg/ml谷氨酰胺（Sigma）、1×105U/L注射用青霉素（華北制藥股份有限公司）、0.1g/L注射用鏈霉素（華北制藥股份有限公司）。
維持培養(yǎng)基：添加5％FBS，其它成份同完全培養(yǎng)基。
LT ：由北京農(nóng)學(xué)院微生物實驗室制備、鑒定[4]。
白頭翁素：購自天津中醫(yī)藥研究所。
NO檢測試劑盒：購自深圳晶美生物工程公司。
1.2試驗方法
1.2.1腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞傳代培養(yǎng)：

    選取第七代腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞，進行傳代，平均接種于48孔培養(yǎng)板內(nèi)，靜止培養(yǎng)。細胞定時計數(shù)，待數(shù)量增至1.0×105時，選取40孔細胞用于試驗。

1.2.2細胞分組：
將細胞按以下方案分為四組。
對照組：用維持培養(yǎng)基培養(yǎng)；
LT組：用含有10mg/ml LT的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)；
白頭翁素組：用含有5mg /ml白頭翁素的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)；
LT＋白頭翁素組：用含有10mg/ml LT的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)1h后，再添加白頭翁素繼續(xù)培養(yǎng)。
1.2.3樣品采集和NO測定
    各組細胞分別培養(yǎng)3h、6h后，依次收集培養(yǎng)上清液（每組收集5孔），3000rp/m離心10min后，分別收集于小離心管中。按NO檢測試劑盒（硝酸還原酶法）操作說明，于530nm處檢測各樣品OD值，按公式計算NO水平。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理    以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗進行顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
    各組細胞分泌NO的量見附表，由表可知：（1）在3h和6h內(nèi)，LT組細胞分泌NO量均極顯著高于對照組；（2）在3h和6h內(nèi)，白頭翁素組細胞分泌NO的量與對照組之間差異均不顯著；（3）在3h和6h內(nèi)，LT＋白頭翁素組細胞分泌NO量均極顯著低于LT組。
    以上結(jié)果表明：10mg/ml LT可刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO升高；10mg/ml白頭翁素對正常培養(yǎng)的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞NO的分泌無明顯影響；5mg /ml白頭翁素可顯著抑制LT引起的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO升高。

附表.白頭翁素對LT刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO的影響（±sμmol/L ，n=5）

Table: The effect of anemones on the level of NO in the rat intestinal mucous microvascular endothelial cells exposed under LT. （±sμmol/L ，n=5）

組別	劑量 mg/ml	3hNO μmol/L	6hNO μmol/L
對照組	0	21.43±1.34	16.60±1.26
LT組 白頭翁素組 LT＋白頭翁素組	10 5 10＋5	26.68±1.18* 21.22±2.18** 17.54±1.47Δ	34.77±1.43* 16.46±1.43** 16.39±1.01Δ

（在同一時間段，與對照組比較 *P<0.01，**P>0.05，與LT組比較ΔP<0.01。）
3．討論：
    LT是產(chǎn)毒素性大腸桿菌的主要毒力因子，以往的研究都集中于LT對腸黏膜上皮細胞功能的影響，并認為上皮細胞是LT的特異性靶細胞[5]。隨著對內(nèi)皮細胞功能的不斷深入，人們開始逐漸認識到腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞在細菌毒素引起的腸道疾病中起十分重要的作用。有人認為，由細菌毒素引起的腸道微血管內(nèi)皮細胞反應(yīng)異常，如微血管通透性增加、中性粒細胞聚集及微血管收縮等，是導(dǎo)致腸炎的重要致病機制[6]。考慮到腸黏膜微血管緊接上皮細胞層，是循環(huán)系統(tǒng)的末端，其通透性升高是導(dǎo)致黏膜水腫和水鹽流入腸腔的前提，因此，我們推測，腸毒素除了損傷腸黏膜上皮細胞，甚至更為重要的是損傷到腸黏膜內(nèi)皮細胞，引起腸道通透性升高，從而導(dǎo)致腹瀉。本試驗結(jié)果LT能顯著刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO升高，結(jié)合NO的增加微血管通透性效應(yīng)，證實了我們的觀點。
    白頭翁是治療細菌性痢疾的重要中藥，對其有效成分作用機理的研究無疑有助于臨床用藥。本試驗調(diào)查了白頭翁素對正常培養(yǎng)的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞以及對LT刺激后的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO的影響。結(jié)果表明，5mg /ml白頭翁素對正常腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO無明顯影響，但可抑制LT引起的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO升高。推測這種抑制作用，可通過以下4種途徑實現(xiàn)：①直接破壞LT的活性結(jié)構(gòu)；②與LT競爭腸黏膜內(nèi)皮細胞上的受體；③參與LT刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞合成和分泌NO的中間過程；④直接影響NO的分泌。從LT對正常培養(yǎng)腸黏膜內(nèi)皮細胞分泌NO無明顯影響的結(jié)果，可以排除④的可能性，但確切的機制尚需進一步研究。據(jù)研究報道，NO可作為內(nèi)皮細胞損傷的標(biāo)志物[7]，因此可以推論，白頭翁素對LT引起的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用。這對于防止腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞免受LT造成損傷和防治大腸桿菌病具有重要意義。