高溫下清涼沖劑對(duì)雞免疫器官中CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量影響的動(dòng)態(tài)觀察

貔貅

摘要目的：旨在通過(guò)研究清涼沖劑對(duì)雞免疫器官中CD4+、CD8+T細(xì)胞含量的動(dòng)態(tài)變化影響，探討其在高溫狀態(tài)下對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫機(jī)能的作用效果，為研究清涼沖劑的藥理作用提供理論依據(jù)。方法：108只農(nóng)大3號(hào)35日齡公雛，隨機(jī)分為3組，每組36只雞，分別為常溫對(duì)照組、高溫對(duì)照組和高溫用藥組，用藥組飼喂中藥煎劑（濃度為1g/ml），喂藥量與飼料量比為1：1000。在實(shí)驗(yàn)的第1、4、8、10天各組剖殺5只，分別采取胸腺、脾臟、法氏囊，利用免疫組化方法測(cè)定各免疫器官中CD4+、CD8+T細(xì)胞含量。結(jié)果：在高溫過(guò)程中，用藥組免疫器官中CD4+、CD8+T細(xì)胞水平均高于高溫對(duì)照組，且以第8天最明顯，差異顯著或極顯著。結(jié)論：清涼沖劑可以提高高溫下雞免疫器官中CD4+、CD8+T細(xì)胞的含量，表明清涼沖劑在高溫環(huán)境下可以有效增強(qiáng)雞的細(xì)胞免疫水平。
關(guān)鍵詞清涼沖劑 CD4+ CD8+T 細(xì)胞免疫免疫組化

Dynamic Effect of Qingliang Decoction to CD4+ and CD8+T cell Average Positive Rate in the Immune Organs of Chicken Under Heat-Stress

Li xinguo1,2Xu jianqin3Hu yanxin3 Xu guangke1,2 Liu fenghua2

（1,Xinjiang Agricultural University, Xinjiang 830052; 2Beijing Agricultural College, Beijing 102206;

3,China Agricultural University, Beijing 100094）

AbstractThe aim of this experiment was to study the effects of Qingliang decoction through detecting the average positive rate of CD4+、CD8+T in the immune organs of chicken under high temperature. One hundred and eight Nongda 1 male chicken were randomly divided into 3 groups. It included of two controls without the decoction under normal and high temperature; and another treatment toke orally Qingliang decoction (0.1% of ration) in water under high temperature. Then the thymu, spleen, and bursal from each group were collected to detect the average positive rate of CD4+、CD8+ T－cell by immunohistochemistry and Motic image analyzing system. The results showed that the treatment with Qingliang decoction under high temperature increased gradually during the experiment period. It indicates that the Qingliang decoction may increase the average positive rate of CD4+、CD8+T-cell in immune organs under the heat-stress, improve the immune function.
Key WordQingliang decoction, CD4+,CD8+, Cell immune, Immunohistochemisty
    高溫影響肉雞的生長(zhǎng)發(fā)育及生產(chǎn)性能，同時(shí)對(duì)機(jī)體的免疫機(jī)能產(chǎn)生很大影響，是誘發(fā)疫病流行的重要應(yīng)激因素之一[1]。大量實(shí)驗(yàn)證明，熱應(yīng)激是通過(guò)作用于下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸促使糖皮質(zhì)激素分泌，從而抑制機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫[2] [3]。機(jī)體的細(xì)胞免疫主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)來(lái)完成，根據(jù)其表面標(biāo)志可將其分為兩大類，即CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，是T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志[4]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)免疫器官中成熟T細(xì)胞，即CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化為指標(biāo)，探討在高溫環(huán)境下清涼沖劑對(duì)雞細(xì)胞免疫功能的影響，為清涼沖劑的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
試驗(yàn)動(dòng)物：農(nóng)大3號(hào)35日齡公雛108只，購(gòu)自北京昌平區(qū)試驗(yàn)雞場(chǎng)。
中藥清涼沖劑：由石膏(Gypsum Fibrosum)、藿香(Herba Agastachis)、蒼術(shù)(RhizomaAtractylodis)、黃柏(Cortex Phellodendri)按等比例組成。
儀器及試劑：鼠抗雞CD4+、CD8+單抗，Southern Biotechnology,Inc產(chǎn)品；HistostainTM-Plus Kits:ZYMED公司SP-9002免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DABKit:顯色劑，美國(guó)ZYMED公司產(chǎn)品（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；BH2 Olympus生物顯微鏡；AO820型切片機(jī)（Amersham optical）；Motic病理圖像分析系統(tǒng)3.0
1.2試驗(yàn)方法

1.2.1分組試驗(yàn)從35日齡起至45日齡，試驗(yàn)期10天。隨機(jī)平均分為3組，分別為常溫對(duì)照組、高溫對(duì)照組、高溫用藥組，每組36只雞。

表1：試驗(yàn)分組

table1:the grouping ofexperimentation

常溫對(duì)照組（22℃） normal temperature control	高溫對(duì)照組（26～39℃） high temperature control（26～39℃）
常溫對(duì)照組 normal temperature control	高溫對(duì)照組 high temperature control	高溫用藥組 group 1

1.2.2人工氣候艙溫度曲線設(shè)計(jì)：（見(jiàn)圖1）

1.2.3飼養(yǎng)管理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼喂北京震亞飼料廠生產(chǎn)的蛋雞全價(jià)料，高溫用藥組飼喂中藥清涼沖劑，喂藥量與飼料量比為1：1000；對(duì)照組自由采食，進(jìn)入人工氣候倉(cāng)適應(yīng)3天后開(kāi)始熱應(yīng)激，共10天。24小時(shí)循環(huán)變溫。變溫曲線見(jiàn)圖1。常溫組始終保持22℃。

1.2.4采樣及切片制備各組分別于熱應(yīng)激第1、4、8、10天高溫結(jié)束后隨機(jī)選取5只雞剖殺，分別采取脾臟、胸腺、法氏囊，用生理鹽水沖洗干凈并及時(shí)置于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟切片，免疫組化染色，使用Motic病理圖像分析系統(tǒng)照相并進(jìn)行平均陽(yáng)性率的灰度分析。

平均陽(yáng)性率灰度分析方法如下：

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法數(shù)據(jù)使用DPS3.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行平均數(shù)、方差分析。

2 結(jié)果

2.1高溫下清涼沖劑對(duì)脾臟中CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量影響的動(dòng)態(tài)觀察（表2）

表2高溫下清涼沖劑對(duì)雞脾臟中CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響(,n=5)

Table2. Effect of Qingliang decoction tothe average positive rate of CD4+、CD8+Tin
the spleen ofchicken under heat-stress單位（unit）：%

脾臟		第1天（1stday）	第4天（4thday）	第8天（8thday）	第10天（10thdya）
常溫對(duì)照組 normal control	CD4+T	45.476±0.514	46.105±0.358	45.273±0.462	45.539±0.524
	CD8+T	35.476±1.492	35.803±0.487	34.749±0.348	35.037±0.378
高溫對(duì)照組 high control	CD4+T	27.829±0.687＃＃	32.787±0.629＃＃	33.724±0.842＃＃	34.69±0.529＃＃
	CD8+T	24.235±0.761＃＃	28.352±1.237＃＃	28.365±0.328＃＃	30.639±0.125＃＃
高溫用藥組 drug group	CD4+T	28.451±0.542	33.161±0.237	44.256±0.628**	43.635±0.347**
	CD8+T	25.198±0.328	29.152±1.028	34.265±0.349**	35.195±0.529**

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01，與常溫對(duì)照組比較；* P<0.05, ** P<0.01,與高溫對(duì)照組比較）

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01,compared with the normal control; * P<0.05, ** P<0.01,compared with the high control）

    從表2中可以看出，常溫對(duì)照組中CD4+、CD8+T細(xì)胞量保持一較穩(wěn)定狀態(tài)；高溫對(duì)照組中雖然呈現(xiàn)一上升的趨勢(shì)，但其含量遠(yuǎn)低于常溫對(duì)照組，且各天差異都極顯著（P<0.01）；高溫用藥組也呈現(xiàn)一上升的趨勢(shì)，各天均高于高溫對(duì)照組，與高溫對(duì)照組相比較，第8、10天差異極顯著（P<0.01）。

2.2高溫下清涼沖劑對(duì)胸腺中CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量影響的動(dòng)態(tài)觀察（表3）

表3高溫下清涼沖劑對(duì)雞胸腺中CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響(,n=5)

Table3. Effect of Qingliang decoction tothe average positive rate of CD4+、CD8+Tin the thymus of

chicken under heat-stress單位（unit）：%

胸腺		第1天（1stday）	第4天（4thday）	第8天（8thday）	第10天（10thdya）
常溫對(duì)照組 normal control	CD4+T	43.473±0.286	42.827±0.624	43.193±0.318	43.718±0.831
	CD8+T	30.589±0.134	31.257±0.825	31.029±1.05	31.729±1.27
高溫對(duì)照組 high control	CD4+T	29.784±1.52＃＃	34.627±0.516＃＃	34.682±0.642＃＃	36.572±0.487＃＃
	CD8+T	20.563±1.06＃＃	22.365±0.457＃＃	25.369±0.189＃＃	26.321±0.382＃＃
高溫用藥組 drug group	CD4+T	30.211±0.854	35.478±1.31	41.256±0.628**	42.635±0.649**
	CD8+T	21.152±0.482	23.258±0.458	30.236±0.492**	30.365±0.584**

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01，與常溫對(duì)照組比較；* P<0.05, ** P<0.01,與高溫對(duì)照組比較）

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01,compared with the normal control; * P<0.05, ** P<0.01,compared with the high control）

    從表3中可以看出，常溫對(duì)照組中CD4+、CD8+T細(xì)胞含量保持一較穩(wěn)定狀態(tài)；高溫對(duì)照組中雖然呈現(xiàn)一上升的趨勢(shì)，但其含量遠(yuǎn)低于常溫對(duì)照組，且各天差異都極顯著（P<0.01）；高溫用藥組也呈現(xiàn)一上升的趨勢(shì)，各天均高于高溫對(duì)照組，于第8天達(dá)到最大差異值6.574、4.867，與高溫對(duì)照組相比較，第8、10天差異極顯著（P<0.01）。

2.3高溫下清涼沖劑對(duì)法氏囊中CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量影響的動(dòng)態(tài)觀察（表4）

表4高溫下清涼沖劑對(duì)雞法氏囊中CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響(,n=5)

Table4. Effect of Qingliang decoction tothe average positive rate of CD4+、CD8+Tin the bursa of

chicken under heat-stress單位（unit）：%

法氏囊		第1天（1stday）	第4天（4thday）	第8天（8thday）	第10天（10thdya）
常溫對(duì)照組 normal control	CD4+T	28.4±0.567	28.647±0.927	28.516±0.634	28.459±0.260
	CD8+T	34.052±0.478	34.374±0.305	33.746±0.286	34.827±0.542
高溫對(duì)照組 high control	CD4+T	14.876±0.371＃＃	23.765±0.674＃＃	25.298±0.548＃＃	23.685±0.628＃＃
	CD8+T	24.852±0.492＃＃	28.689±0.255＃＃	29.302±0.347＃＃	29.624±0.127＃＃
高溫用藥組 drug group	CD4+T	15.361±0.167	24.345±0.329	28.055±0.274**	25.797±0.561**
	CD8+T	25.161±0.682	38.945±0.286	34.105±0.821**	33.797±0.319**

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01，與常溫對(duì)照組比較；* P<0.05, ** P<0.01,與高溫對(duì)照組比較）

（＃P<0.05,＃＃ P<0.01,compared with the normal control; * P<0.05, ** P<0.01,compared with the high control）

    從表4中可以看出，常溫對(duì)照組中CD4+、CD8+T細(xì)胞含量保持一較穩(wěn)定狀態(tài)；高溫對(duì)照組中雖然呈現(xiàn)一上升的趨勢(shì)，但其含量遠(yuǎn)低于常溫對(duì)照組，且各天差異都極顯著（P<0.01）；高溫用藥組也呈現(xiàn)一上升的趨勢(shì)，各天均高于高溫對(duì)照組，于第8天達(dá)到最大差異值2.757、4.853，與高溫對(duì)照組相比較，第8、10天差異極顯著（P<0.01）。
3 討論與結(jié)論
    CD4+、CD8+是相互關(guān)聯(lián)、但意義不同的2個(gè)分子，是T細(xì)胞亞群的表面標(biāo)志。表達(dá)CD4+的主要是輔助性T細(xì)胞，表達(dá)CD8+的主要是細(xì)胞毒性T細(xì)胞。CD4+和CD8+分子可增強(qiáng)CD3-TCR對(duì)MHC抗原的親和力，并有助于激活信號(hào)的傳遞。CD4+分子增強(qiáng)對(duì)MHCⅡ類抗原的結(jié)合，CD8+分子則增強(qiáng)對(duì)MHCⅠ類抗原的結(jié)合[5]。CD4+T淋巴細(xì)胞作為調(diào)節(jié)細(xì)胞，主要是啟動(dòng)免疫應(yīng)答和控制初次感染；而CD8+T淋巴細(xì)胞作為一種效應(yīng)細(xì)胞，則是抵抗再感染的主力。二者分工不同，但又密不可分。通過(guò)釋放各種細(xì)胞因子，相互促進(jìn)，相互協(xié)調(diào)，共同完成抗感染作用。Gazziindlli(1999)也證實(shí)了CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞在抵抗感染中的協(xié)同作用[6]。Lisa,Trout等人試驗(yàn)也說(shuō)明，CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞免疫中起主要作用[7，8]。故可通過(guò)對(duì)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量多少的測(cè)定來(lái)判定機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。
    胸腺是機(jī)體重要的中樞免疫器官之一， T淋巴細(xì)胞在胸腺中成熟，獲得其功能及學(xué)習(xí)識(shí)別自我，完成T淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性選擇(識(shí)別抗原/MHC的克隆增殖,成熟并移行至周圍)和陰性選擇(排除能將自身抗原作為異物起反應(yīng)的克隆)的雙重功能。并決定外周免疫器官的發(fā)育。脾臟是最大的外周免疫器官，也是發(fā)生免疫反應(yīng)的主要場(chǎng)所。法氏囊是禽類特有的中樞免疫器官，是B細(xì)胞繁殖分化的主要場(chǎng)所，但同時(shí)它還作為外周淋巴器官，捕捉抗原和合成某些抗體，存在少量的T淋巴細(xì)胞[9]。
    從試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)看，高溫環(huán)境明顯對(duì)雞各免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞具有抑制作用，高溫對(duì)照組明顯低于常溫對(duì)照組，各天差異性都極顯著。清涼沖劑中君藥石膏在20世紀(jì)80年代前主要通過(guò)退熱作用，探討其作用機(jī)制。在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，石膏亦能夠非特異性增強(qiáng)動(dòng)物細(xì)胞及體液免疫水平[10，11，12]。本實(shí)驗(yàn)中高溫用藥組各免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量高于高溫對(duì)照組而低于常溫對(duì)照組，至高溫第8、10天時(shí)基本接近常溫對(duì)照組，其中以第8天差異性最顯著，也說(shuō)明了以石膏為主的中藥復(fù)方對(duì)提高機(jī)體免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞具有很好的促進(jìn)作用，能促使機(jī)體在極端高溫應(yīng)激中迅速恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。
    綜上所述，高溫環(huán)境對(duì)雞免疫器官中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量具有抑制作用，從而降低機(jī)體細(xì)胞免疫水平。復(fù)方清涼沖劑在高溫環(huán)境下對(duì)雞免疫器官中的CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量具有促進(jìn)作用，表明了清涼沖劑可以在高溫環(huán)境下增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能。