川楝素妊娠毒性作用與孕鼠INF-γ、TNF-α含量的相關(guān)性研究

貔貅

長期以來，農(nóng)藥殘留對于公眾健康的危害是以引起癌變作為指標。近年來由于農(nóng)藥殘留對生殖和發(fā)育危害的后果突出，被認為可能是造成不孕、流產(chǎn)、功能異常和畸形等因素之一。有研究表明動物生殖和胚胎發(fā)育過程對農(nóng)藥毒物似乎更加敏感。因此，農(nóng)藥對生殖和發(fā)育的危害及其后果的分析成為生殖和發(fā)育毒物學中重要的研究內(nèi)容，并逐漸進入各國的食品常規(guī)分析和檢測項目中。川楝素(Toosendain)是從傳統(tǒng)驅(qū)蛔中藥楝屬植物川楝樹或苦楝樹的根皮苦楝（Melia azedarach L）皮、川楝（Melia Toosendain Sieb.et Zucc）子中提取的一種四環(huán)三萜類化合物[1,2]。最早于1953年由四川省中藥研究所提取，主要用來驅(qū)蟲，近年來也用于農(nóng)業(yè)殺蟲[3]。關(guān)于楝樹的殺蟲作用，歷史上有不少記載，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記有楝樹“殺三蟲”。蘇東坡所著《格物粗談》中記載，“收苦楝花或葉藏席下可避蚤虱”，“端午取楝子碎投廁中不生蟲”。已有研究表明，一定劑量的川楝素能使小鼠完全流產(chǎn)[4]。現(xiàn)在川楝素多用于蔬菜、瓜果的殺蟲，其在蔬菜、瓜果上殘留的是否對人類尤其是孕婦有潛在的影響呢？研究川楝素對動物的生殖毒性作用和機理，以及劑量和效應(yīng)關(guān)系，對于豐富中藥藥理學內(nèi)容，保證川楝素作為農(nóng)業(yè)殺蟲劑的安全使用，有著重要的意義?！　?　材料和方法　　1.1試驗動物
　　10周齡未經(jīng)產(chǎn)純種BALB/c系小鼠（清潔級），購自河北醫(yī)科大學。常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食。日光照12h。經(jīng)適應(yīng)環(huán)境1周后，眼觀檢查結(jié)合陰道涂片法進行發(fā)情鑒定。陰道涂片經(jīng)姬姆薩染色，鏡下觀察全部為無核角化上皮細胞定位發(fā)情。發(fā)情母鼠與公鼠1：1合籠過夜，于次日清晨，見有陰栓者定位孕0d。
　　1.2試驗藥品及配制
　　川楝素提取物（含量90%），購自深圳市倬源實業(yè)發(fā)展有限公司，用10%丙二醇生理鹽水（經(jīng)細菌濾器過濾消毒）稀釋成20μg/mL。
小鼠TNF-α、INF-γ ELISA試劑盒，R＆D Systems明尼阿波利斯，明尼蘇達州，美國，購自晶美生物公司。
　　1.3試驗動物分組與處理
　　試驗分5組。經(jīng)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，腹腔注射10%丙二醇生理鹽水對孕鼠的妊娠沒有影響。A組在孕5、6、7d時腹腔注射10%丙二醇生理鹽水。川楝素對小鼠的腹腔注射LD50是13.8mg/kg[4]，B、C、D、E組孕鼠在孕5、6、7d時分別腹腔注射川楝素溶液1/60 LD50、1/30 LD50、1/20 LD50、1/15 LD50。注射前用天平稱取每只小鼠的體重，計算注射劑量。于孕8d眼球采血處死小鼠，取上清，用于測定血液中細胞因子的含量；取右側(cè)子宮勻漿，測定細胞因子的含量。
　　1.4流產(chǎn)判定及胚胎吸收率、流產(chǎn)率的計算
胚胎體積變小、顏色紫黑、出血壞死、呈血團狀、鏡檢無胎膜結(jié)構(gòu)為胚胎吸收或死亡。胚胎個體大，粉紅色，鏡檢胎膜及胎兒輪廓清晰，無出血、淤血者為正常胚胎。按下列公式[5]計算試驗各組的流產(chǎn)率和胚胎吸收率。
　　流產(chǎn)率=發(fā)生流產(chǎn)的母鼠數(shù)/試驗組母鼠總數(shù)×100%
　　胚胎死亡（吸收）率=死亡胚胎數(shù)/（死亡胚胎數(shù)+正常胚胎數(shù)）×100%
　　1.5TNF-α、INF-γ的測定
　　眼球采血，12000r/m，4℃離心10min,取上清液分裝備用。取右側(cè)子宮，剪除子宮系膜及脂肪，縱向切開子宮，剝?nèi)ヌ海羲樽訉m角，加入6倍于子宮質(zhì)量的含有PMSF（蛋白酶抑制劑0.75μg/mL）的PBS（pH7.4）。在冰水環(huán)境中立即進行勻漿，12000r/m, 4℃，離心15min，取上清液分裝，-80℃凍存待檢。TNF-α、INF-γ的測定均按試劑盒說明操作。加終止液后即刻在318MC型酶標分析儀(上海三科儀器有限公司)450nm處讀取OD值，利用已知濃度的標準樣品OD值繪制標準曲線，據(jù)此標準曲線計算各細胞因子含量。
　　1.6統(tǒng)計方法
　　使用Excel 2000和SPASS12軟件包,以單變量方差分析和卡方檢驗進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均值±標準差()表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。
　　2　結(jié)果　　2.1川楝素溶液致早期孕鼠流產(chǎn)的效果
　　對照組A組本身有一定的自然流產(chǎn)率14.29%，胚胎吸收率13.04%；B組流產(chǎn)率50.00%，與A組相比較，流產(chǎn)率差異不顯著（P>0.05），胚胎吸收率為42.59%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）；C組流產(chǎn)率為 62.5%，與A組比較差異顯著（P<0.05），胚胎吸收率為46.55%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）；D組流產(chǎn)率為 75.00%，與A組比較差異顯著（P<0.05），胚胎吸收率為70.37%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）；E組流產(chǎn)率為 89.89%，與A組比較差異極顯著（P<0.01），胚胎吸收率為73.77%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）。胚胎吸收率B組與D、E組比較差異極顯著P<0.01）；C組與D組比較差異顯著（P<0.05），與E組比較差異極顯著（P<0.01）；D、E組間差異不顯著（P>0.05）。B、C、D、E各組之間流產(chǎn)率差異不顯著（P>0.05）。詳見表1。

　　表1　不同劑量川楝素的流產(chǎn)效果

組別 roup	流產(chǎn)率(%) Abortion rate(%)		胚胎吸收比率(%) Rate of embryo resorption(%)
A對照組		14.29%(1/7) cdE		13.04%(6/46)BCDE
B組 1/60LD50川楝素注射液		50.00%(4/8)		42.59%(23/54)ADE
C組1/30LD50川楝素注射液		62.50%(5/8)a		46.55%(17/58)AdE
D組1/20LD50川楝素注射液		75.00%(6/8)a		70.37%(38/54)ABc
E組1/15LD50川楝素注射液		88.89%(8/9)A		73.33%(44/60)ABC

　　注：小寫字母不同表示差異顯著（P<0.05）,大寫字母不同表示差異極顯著（P<0.01），以下同。
　　2.2血清和子宮組織中TNF-α測定結(jié)果
　　川楝素可以提高血清和子宮組織中TNF-α的含量。B組注射1/60 LD50的川楝素溶液，TNF-α在子宮組中含量為1893.378±61.236pg/g蛋白，顯著高于對照組A組（P<0.05），在血清中含量為31.938±9.827 pg/mL，顯著高于對照組A組（P<0.05）；C組注射1/30 LD50的川楝素溶液， INF-γ在子宮組織中含量為2263.128±281.934pg/g蛋白，極顯著高于對照組A組（P<0.01），血清中含量為55.979±29.753 pg/mL，極顯著高于對照組A組（P<0.01）；D組注射1/20 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為2008.374±175.374pg/g蛋白，極顯著高于對照組A組（P<0.01），血清中含量為43.438±14.965 pg/mL，極顯著高于對照組A組（P<0.01）；E組注射1/15 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為1997.436±271.146pg/g蛋白，極顯著高于對照組A組（P<0.01），血清中含量為32.688±11.264 pg/mL，顯著高于對照組A組（P<0.05）。子宮組織中INF-γ含量C組與B組比較差異顯著（P<0.05），血清中的INF-γ含量C組與B組、E組比較差異顯著（P<0.05）。詳見表2。

　　表2　各處理組血清和子宮組織中TNF-α的含量

組別 Group	血清(pg/mL) Blood sperum (pg/mL)	子宮組織（pg/g） Uterus tissue (pg/g)
A對照組	3.729±0.144bCDe	1439.628±163.074bCDE
B組1/60LD50川楝素注射液	31.938±9.827ad	1893.378±61.236ac
C組1/30LD50川楝素注射液	55.979±29.753Abe	2263.128±281.934Ab
D組1/20LD50川楝素注射液	43.438±14.965A	2008.374±175.374A
E組1/15LD50川楝素注射液	32.688±11.264ad	1997.436±271.146 A

　　2.3血清和子宮組織中INF-γ測定結(jié)果
　　川楝素可以提高血清和子宮組織中INF-γ的含量。B組注射1/60 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮組中含量為3724.998±421.212pg/g蛋白，顯著高于對照組A組（P<0.05），在血清中含量為42.656±15.118pg/ pg/mL，極顯著高于對照組A組（P<0.01）；C組注射1/30 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮組織中含量為4182.402±608.154pg/g蛋白，極顯著高于對照組A組（P<0.01），血清中含量為56.250±22.991 pg/mL，極顯著高于對照組A組（P<0.01）；D組注射1/20 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為3805.002±243.864pg/g蛋白，顯著高于對照組A組（P<0.05），血清中含量為37.813±10.7892 pg/mL，顯著高于對照組A組（P<0.05）；E組注射1/15 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為3633.600±374.568pg/g蛋白，顯著高于對照組A組（P<0.05），血清中含量為34.219±8.646 pg/mL，極顯著高于對照組A組（P<0.01）。INF-γ在子宮組織中的含量各實驗組之間差異不顯著（P>0.05）；血清中的INF-γ含量C組與B組比較差異不顯著（P>0.05），與D組相比較差異顯著（P<0.05），與E組比較差異極顯著（P<0.01）。詳見表3。

表3　各處理組血清和子宮組織中INF-γ的含量

組別 Group	血清(pg/mL) Blood sperum (pg/mL)	子宮組織（pg/g） Uterus tissue (pg/g)
A對照組	6.000±0.354BCde	2743.998±169.704bCde
B組1/60LD50川楝素注射液	42.656±15.118A	3724.998±421.212a
C組1/30LD50川楝素注射液	56.250±22.991AdE	4182.402±608.154A
D組1/20LD50川楝素注射液	37.813±10.7892ac	3805.002±243.864a
E組1/15LD50川楝素注射液	34.219±8.646aC	3633.600±374.568a

　　3.討論
　　孕8d剖檢，1/30LD50的劑量使孕鼠達到62.5%的流產(chǎn)率，與對照組比較差異顯著。1/20LD50、1/15LD50川楝素溶液由于導(dǎo)致75%、88.89%流產(chǎn)，因此劑量偏大，不適合做流產(chǎn)模型；而1/60LD50的流產(chǎn)率又偏小，1/30LD50的劑量使流產(chǎn)率達到62.5%，又有一定的成活的胚胎，與對照組比較顯著差異（詳見表1）。因此，1/30LD50的川楝素溶液流產(chǎn)效果比較理想，所以選擇1/30LD50為川楝素致流產(chǎn)的最佳劑量。
　　川楝素本身有一定的毒性。腹腔注射大劑量川楝素可引起急性中毒，主要致死原因是由于血管壁通透性增加，引起內(nèi)臟出血，血壓下降而形成急性循環(huán)衰竭。張先福研究表明[4]，給妊娠早期母鼠腹腔注射最大劑量不到1/10的LD50（13.8mg/kg）川楝素，就會使胚胎異常，產(chǎn)生毒性作用。本研究給孕5d的小鼠連續(xù)3d腹腔注射川楝素溶液，通過解剖發(fā)現(xiàn)，具有子宮出血、子宮水腫，胚胎死亡的孕鼠數(shù)量顯著高于對照組（P<0.05）說明川楝素的致流產(chǎn)作用明顯，與前人的工作是相吻合的。由本研究結(jié)果可以看出，給孕5d的小鼠注射川楝素溶液后，TNF-α、IFN-γ的含量顯著增加，說明川楝素可以促進Th1細胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌。
　　本試驗結(jié)果表明，孕5d小鼠注射不同劑量的川楝素溶液后，在導(dǎo)致流產(chǎn)的同時TNF-α、IFN-γ的含量升高。TNF-α和IFN-γ都屬于Th1型細胞因子。近年來，普遍認為早期胚胎丟失與子宮免疫環(huán)境有密切關(guān)系，提出白介素-2（Interferon-2,IL-2）、腫瘤壞死因子（Tumour necrosis factor,TNF）,以及γ-干擾素（Interferon-γ）等可導(dǎo)致胚胎死亡[6]。
　　TNF-α主要由Th1細胞分泌，活化NK細胞和肥大細胞也分泌一部分[7]。TNF-α導(dǎo)致流產(chǎn)已被動物試驗所證實。Gendron等報道，LPS誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)與子宮內(nèi)的TNF-α增多有直接關(guān)系[8]。將人工重組TNF-α直接注入孕鼠體內(nèi)，亦可引起流產(chǎn)[9]。同時，TNF-α能抑制滋養(yǎng)層細胞DNA合成及增生。TNF-α為重要的炎癥介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子，是造成胎盤壞死的終末介導(dǎo)物之一。 TNF-α對生殖過程有重要影響[10,11 ],在小鼠的懷孕期被嚴格地控制著[12] 。TNF-α異常對妊娠時胚胎存活是有害的[13]，母體TNF-α可能影響囊胚生長和著床[14,15]
　　TNF-α在黃體形成期起著重要的調(diào)節(jié)作用，抑制胚泡著床[16]。TNF-α能誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細胞凋亡，促進胎盤血管血栓形成，誘發(fā)宮縮使著床的胚胎壞死、排出。TNF-α與IL-2共同作用還可使NK細胞活化，損害胎盤組織。TNF-α參與抗體依賴細胞毒作用，并使前列腺素增多導(dǎo)致流產(chǎn)[17]。但是大量資料表明，正常妊娠期間適量TNF-α能促進分解代謝，從而滿足胎兒的營養(yǎng)需要，對其他細胞因子及黏附分子的表達具有一定的調(diào)節(jié)作用，在維持正常妊娠的順利進行中必不可少，參與了妊娠期間免疫平衡的建立和穩(wěn)定[18]。
　　IFN-γ主要來自活化的T細胞、NK細胞、胎盤滋養(yǎng)層細胞及絨毛間質(zhì)霍夫包爾氏細胞， IFN-γ通過誘導(dǎo)單核巨噬細胞的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）-Ⅱ類抗原表達，參與抗原遞呈和特異性免疫識別過程[19]。原因不明習慣性流產(chǎn)患者血清中平均IFN-γ含量明顯高于正常對照組（P﹤0.05）[20]。試驗證明，一定濃度范圍的IFN-γ（10~1000ng/mL）可明顯抑制絨毛膜滋養(yǎng)層細胞活性及其hCG分泌，其抑制作用呈劑量依賴性[21]。IFN-γ/IL-4可能通過影響胎盤滋養(yǎng)層細胞活性及hCG分泌而在早期妊娠中起重要的免疫調(diào)節(jié)作用[22]。由此可以說明，IFN-γ濃度的升高伴隨著hCG分泌量得降低，從而不利于妊娠的進行。曹永清等人發(fā)現(xiàn)人重組IFN-γ對人子宮蛻膜組織蛋白的合成呈抑制作用，給孕兔注射導(dǎo)致胚泡著床率降低80%左右。IFN-γ能夠活化Mφ,使其具有抗原遞呈能力，此種作用可以被IL-10抑制[23]。體外試驗證明，IFN-γ抑制滋養(yǎng)層的生長，IFN-γ與INF-α協(xié)同作用可抑制胚胎的生長發(fā)育，上調(diào)胚胎MHC-I類抗原的表達，IL-2誘導(dǎo)蛻膜NK樣細胞增殖并使其轉(zhuǎn)化為具有殺傷滋養(yǎng)層細胞的表型。Th1型細胞因子可能通過激活NK細胞與LAK細胞而作用于胎兒胎盤組織，導(dǎo)致妊娠失敗[24]。白血病抑制因子（LIF）和IFN-γ都是由母胎界面的細胞和組織所分泌，LIF促進胚胎的著床有利于妊娠的進行，IFN-γ卻不利于妊娠[25]。
　　本試驗結(jié)果表明，苦楝皮及其單體成分川楝素能導(dǎo)致孕鼠流產(chǎn)，使子宮內(nèi)Th1型細胞因子IFN-γ、TNF-α含量升高，從而打破了母胎界面Th1/Th2的平衡，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。