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電梯直達(dá)

樓主

發(fā)表于 2007-12-28 19:32:22 | 只看該作者回帖獎(jiǎng)勵(lì)

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ELISA 常見問題詳解

一 OD值偏低（或陽性對(duì)照不顯色）
1試劑盒從冰箱拿出后未充分平衡室溫（指實(shí)驗(yàn)室的操作溫度，20～25℃）。如果在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來即用，可能會(huì)導(dǎo)致后面溫育時(shí)間不夠，造成OD值偏低。
2移液器吸液量不足、吸頭內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔。例如吸頭與加樣器未擰緊，導(dǎo)致吸取樣品時(shí)有少量空氣占據(jù)了樣品的位置，使得加樣量不足；加樣時(shí)未預(yù)洗（把第一次吸取的樣品打掉再吸），使得部分樣品粘留在吸頭上，造成加樣量不足；加樣時(shí)把樣品加在孔壁上部的非包被區(qū)，導(dǎo)致非特異性吸附；吸頭殘留有樣品，導(dǎo)致加樣量不足；加樣時(shí)把吸頭尖部伸入液底，取出時(shí)不僅會(huì)粘到部分樣品或稀釋液，還容易劃破包被板和引起污染。這些操作均可造成OD值偏低。
3操作順序顛倒或遺漏步驟。如果操作人員大意或不嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（如漏加酶結(jié)合物、顯色劑等），很容易造成實(shí)驗(yàn)失敗，導(dǎo)致整塊ELISA板都不顯色。
4溫育時(shí)間不夠。如保溫用的濕盒沒有預(yù)溫（尤其在氣溫較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能會(huì)比較長(zhǎng)），未平衡溫度，會(huì)相對(duì)縮短反應(yīng)時(shí)間，使OD值偏低。
5溫育溫度未達(dá)到要求。培養(yǎng)箱溫度不符合操作要求，影響溫度恒定，非隔水式培養(yǎng)箱尤其應(yīng)注意這一點(diǎn)。
6洗板液在配置過程中出現(xiàn)問題。如量筒不干凈，量筒或水中含酶抑制物（如疊氮鈉）等；洗板液濃度太高（洗板液一般為含0.05％吐溫-20的堿性磷酸鹽溶液，當(dāng)吐溫-20濃度高于0.2％時(shí)會(huì)使結(jié)合在包被板的產(chǎn)物解吸附），洗去特異性結(jié)合物；配制洗板液時(shí)把別的試劑錯(cuò)當(dāng)成濃縮洗液；配制洗板液前未充分搖勻濃縮洗液（濃縮液在冰箱保存時(shí)由于溫度低下會(huì)有結(jié)晶沉淀），如果配制時(shí)吸取到結(jié)晶的話，會(huì)導(dǎo)致洗板液濃度升高，使得結(jié)合在包被板的產(chǎn)物解吸附，引起OD值偏低。
7洗板時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過長(zhǎng)、洗板次數(shù)過多，都可能洗去結(jié)合在包被板的特異性結(jié)合物，導(dǎo)致OD值偏低。
８加完終止液后沒有輕輕充分混勻ELISA板液就立即讀數(shù)或放置太久才進(jìn)行讀數(shù)（一般3分鐘之內(nèi)進(jìn)行讀數(shù)），都可能使檢測(cè)OD值偏低。
９酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定有誤。一般酶標(biāo)儀在測(cè)讀吸光值時(shí)選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)，TMB用650nm波長(zhǎng)。如果波長(zhǎng)設(shè)定錯(cuò)誤，可能造成OD值偏低。
10配制顯色劑溶液后未及時(shí)使用，或顯色劑未避光保存，或顯色劑作用時(shí)間不夠，或終止液錯(cuò)當(dāng)成顯色劑使用。使用前的TMB底物一般在18～25℃放置或最好在25℃放置，否則很容易使顯色作用時(shí)間相對(duì)不夠，造成OD值偏低。
11試劑盒沒有按規(guī)定保存，受高溫影響。試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng)，保存溫度太高，影響試劑質(zhì)量。一般試劑盒保存在2～8℃，保存過程中要及時(shí)清理冰箱中出現(xiàn)的霜或冰塊，以防霜（或冰塊）與試劑盒粘貼在一起導(dǎo)致其中的試劑由于溫度下降而改變質(zhì)量。
12采樣時(shí)間不當(dāng)。一些畜禽用藥后可能對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果有影響，如地塞米松治療引起的免疫抑制可降低牛結(jié)核分枝桿菌γ－干擾素對(duì)結(jié)核桿菌抗原的應(yīng)答，引起OD值偏低。
13血清如在冰箱中保存過久，其中的一些蛋白質(zhì)（如IgG）可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深，而且放置過久有時(shí)會(huì)造成抗原或抗體免疫活性減弱，亦可使OD值偏低。血清反復(fù)凍融也會(huì)使抗體效價(jià)跌落，造成檢測(cè)OD值偏低。
14試劑失效（尤其是酶結(jié)合物、顯色劑等），試劑盒過期，試劑盒循環(huán)使用次數(shù)過多。
二 OD值偏高（或全部板孔均有顯色）
1實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度太高（>25℃）。有些試劑盒設(shè)定的反應(yīng)溫度是室溫（指實(shí)驗(yàn)室的操作溫度，20～25℃），如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度太高（特別在夏天高溫天氣時(shí)），會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)程度相對(duì)增強(qiáng)，造成OD值偏高。
2一次實(shí)驗(yàn)的樣品量過多，加樣時(shí)間太長(zhǎng)，導(dǎo)致試劑（樣品）的實(shí)際反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，OD值偏高。
3酶加量過多。如移液器不準(zhǔn)，操作人員大意導(dǎo)致同一個(gè)孔重復(fù)加樣，或用移液器加樣時(shí)把移液器按到最底限。
4加底物時(shí)各孔間受酶污染。底物受酶催化發(fā)生顏色變化，導(dǎo)致OD值偏高。
5終止液未搖勻，加樣時(shí)吸到有結(jié)晶的部分，使終止液濃度相對(duì)升高，導(dǎo)致OD值偏高。
6溫育時(shí)ELISA板未蓋上膠膜或未平放在底部墊有濕紗布的盒中，會(huì)使蒸發(fā)的水分很多，對(duì)于整個(gè)反應(yīng)體系來說，各種反應(yīng)物的濃度會(huì)不斷增加，這樣勢(shì)必導(dǎo)致反應(yīng)最后的OD值升高。
6溫育時(shí)溫度過高，酶結(jié)合物反應(yīng)時(shí)間、底物顯色時(shí)間過長(zhǎng)等。
7洗滌不充分，洗后未拍干，板孔中殘留有酶或其他非特異性物質(zhì)等。如果洗滌不徹底（如每孔洗滌液量不夠、每次浸泡時(shí)間不足、洗板次數(shù)不夠等），尤其在最后一次，可能會(huì)有酶結(jié)合物的非特異性吸附或孔內(nèi)多余的抗原（或抗體）不能徹底去除，造成空白值升高；在間接法中，如果血清樣本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗干凈，也將與酶標(biāo)二抗作用而產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致OD值升高。
8洗板液被污染。排槍洗板時(shí)未懸空加入洗液，使吸頭粘到孔中的液體，造成洗滌液被污染，如污染酶等，會(huì)使后面加入的顯色液發(fā)生顏色反應(yīng)而使OD值偏高。
9拍板時(shí)使用易掉渣的紙，使紙屑留在孔中，由于其中含有氧化劑而造成OD值偏高。
10顯色液變質(zhì)。有些顯色液未避光保存或配制后未及時(shí)使用，可能會(huì)產(chǎn)生顏色反應(yīng)，導(dǎo)致OD值偏高。
11水質(zhì)被金屬離子污染。如水中含過多Ca2＋、Mg2＋，這些離子會(huì)占用表面活性劑，影響洗滌效果，導(dǎo)致一些非特異性顯色，造成OD值偏高。一般洗滌用的雙蒸水電導(dǎo)率應(yīng)小于1.5μs/cm，洗液PH值一般在7.4±0.2。
12采樣時(shí)間不當(dāng)。一些畜禽用藥后可能對(duì)ELISA檢測(cè)有影響，如在肉豬的藥物殘留檢測(cè)中，如果采樣前使用過藥物（如安乃近、支原凈、磺胺六甲針、磺胺六甲粉、丁胺卡那、長(zhǎng)效土霉素等）而未過停藥期就進(jìn)行采樣檢測(cè)，很容易引起檢測(cè)OD值偏高。
13樣品質(zhì)量問題。黃疸血清樣品中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，如果用辣根過氧化物酶作為標(biāo)記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。溶血樣品，紅細(xì)胞溶解破裂，會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標(biāo)記的ELISA 測(cè)定中，就可能催化底物液顯色而造成假陽性。樣品被細(xì)菌或霉菌等污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。
14吸頭重復(fù)使用，未潔凈或消毒不完全而用于加酶或底物。
三樣品的重復(fù)性差
1 加錯(cuò)樣品。重復(fù)性檢測(cè)強(qiáng)調(diào)的是同一份樣品，如果加樣時(shí)加錯(cuò)樣品，勢(shì)必導(dǎo)致結(jié)果前后不一致。
2 加樣品及試劑時(shí)量不足或不準(zhǔn)，造成孔間不一致，結(jié)果也會(huì)不一致。
3 加樣太快，孔間易發(fā)生污染，也會(huì)造成加樣量不足，導(dǎo)致前后結(jié)果不一致。
4 把樣品及試劑加在孔壁上部非包被區(qū)。
5 加樣時(shí)間有長(zhǎng)有短，出現(xiàn)時(shí)差反應(yīng)。特別一次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品數(shù)過多，而重復(fù)孔一個(gè)加在最前孔，一個(gè)加在最后孔時(shí)很容易造成結(jié)果不一致。或當(dāng)稀釋倍數(shù)較高時(shí)，如果不先進(jìn)行預(yù)稀釋，就會(huì)延長(zhǎng)加樣時(shí)間，導(dǎo)致樣品間的反應(yīng)時(shí)間相差過大引起結(jié)果差異。
6孔內(nèi)污染雜物。如在拍板時(shí)使用易掉渣的紙，使紙屑留在重復(fù)孔中，由于紙屑含有氧化劑而造成最終的OD值不一致。
7溫育時(shí)間、洗板條件、顯色時(shí)間、操作人員不一致。
8酶標(biāo)儀濾光片不正確。酶標(biāo)儀不穩(wěn)定，測(cè)定重復(fù)性差；酶標(biāo)儀操作時(shí)電壓不穩(wěn)定，使用前未先預(yù)熱15～30分鐘，導(dǎo)致測(cè)讀結(jié)果不穩(wěn)定，易造成檢測(cè)結(jié)果不一致。
9闕值附近時(shí)陰時(shí)陽。可同一樣品做三個(gè)或多個(gè)重復(fù)孔，以兩個(gè)以上相同者為準(zhǔn)。
10不同批號(hào)試劑盒組分混用。
11血清中含蛋白、水分等多種成分，由于比重關(guān)系，靜止保存時(shí)容易分層，如果加樣時(shí)沒有混勻血清而吸入血清的不同部層，可能會(huì)造成結(jié)果不一致。
12如果血清樣品未完全凝固即加入ELISA板孔中，孔內(nèi)可能出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留有血細(xì)胞，容易出現(xiàn)假陽性，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致前后兩次檢測(cè)結(jié)果不一致。