集團(tuán)養(yǎng)殖總部獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室 獸醫(yī)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及其儀器配置
一、
細(xì)菌操作：
第一個(gè)實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)基的制備：
1、目的要求 熟悉培養(yǎng)基制備的基本程序，會(huì)制備常用的培養(yǎng)基，會(huì)測(cè)定并矯正培養(yǎng)基的pH。
2、儀器及材料 高壓蒸汽滅菌器、電熱干燥箱、電爐、天平、量筒、漏斗、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、三角燒瓶、標(biāo)準(zhǔn)比色管、精密pH試紙、紗布、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉、氫氧化鈉、脫纖綿羊血等。
3、方法與步驟 培養(yǎng)基制備的基本程序 配料→溶化→測(cè)定及矯正pH→過(guò)濾→分裝→滅菌→無(wú)菌檢驗(yàn)→備用。
（1）、肉膏湯培養(yǎng)基
成分 牛肉膏3～5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml。
制法 將牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉加水后，加熱溶解。矯正pH至7.4～7.6，過(guò)濾分裝。置高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，121.3℃20min滅菌即成。
用途
可供一般細(xì)菌生長(zhǎng)，同時(shí)也是制作一般培養(yǎng)基的基礎(chǔ)原料。
（2）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
成分 肉膏湯1000ml，瓊脂粉20～30g。
制法 將瓊脂粉加入肉膏湯內(nèi)，煮沸使其完全溶解，矯正pH7.4～7.6，過(guò)濾分裝于試管或三角燒瓶中，以121.3℃滅菌20min?？芍瞥稍嚬苄泵?、高層培養(yǎng)基或瓊脂平板。
用途 此培養(yǎng)基可供一般細(xì)菌的分離培養(yǎng)、純培養(yǎng)，觀察菌落特征及保存菌種等，也可作特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。
（3）、血液瓊脂培養(yǎng)基 將滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂冷至45～50℃,以無(wú)菌操作，加入5%～10%的無(wú)菌血液(或脫纖血)，然后傾注滅菌平皿或分裝試管制成斜面。供營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌分離培養(yǎng)，亦可供溶血性的觀察和保存菌種用。
（4）、半固體培養(yǎng)基 肉湯培養(yǎng)基中加入0.3%～0.5%瓊脂粉制成，用于菌種的保存或細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察。
第二個(gè)實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌標(biāo)本片的制備及染色法：
目的要求 能利用不同的材料進(jìn)行細(xì)菌標(biāo)本片的制備，會(huì)進(jìn)行常規(guī)染色，并認(rèn)識(shí)細(xì)菌的不同染色特性。
儀器及材料
酒精燈、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、生理鹽水、美藍(lán)染色液、革蘭氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、顯微鏡、香柏油、乙醇乙醚、擦鏡紙、細(xì)菌培養(yǎng)物(大腸桿菌、葡萄球菌等)、細(xì)菌病料、無(wú)菌鑷子和剪刀、特種鉛筆等。
方法與步驟
1、細(xì)菌標(biāo)本片的制備
抹片 根據(jù)所用材料不同，抹片的方法亦有差異。
(1)固體培養(yǎng)物 取潔凈的玻片一張，把接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌后，取1～2環(huán)的無(wú)菌生理鹽水，放于載玻片的中央，再將接種環(huán)滅菌，冷卻后，從固體培養(yǎng)基上挑取菌落或菌苔少許，與水混勻，作成直徑1cm的涂面。接種環(huán)用后需滅菌。
(2)液體培養(yǎng)物 可直接用滅菌接種環(huán)鉤取細(xì)菌培養(yǎng)液1～2環(huán)，在玻片上作直徑1cm的涂面。
(3)液體病料(血液、滲出液、腹水等) 取一張邊緣整齊的載玻片，用其一端醮取血液等液體材料少許，在另一張潔凈的玻片上，以45°角均勻推成一薄層的涂面。
(4)組織病料 以無(wú)菌剪刀、鑷子剪取被檢組織一小塊，以其新鮮切面在玻片上做3～5個(gè)壓印或涂抹成適當(dāng)大小的一薄層。
無(wú)論何種方法，切忌涂抹太厚，否則不利于染色和觀察。
干燥 涂片應(yīng)在室溫下自然干燥，必要時(shí)將涂面向上，置火焰高處微烤加熱干燥。
固定 固定的方法因染色方法不同而異。
(1)火焰固定 是最常用的方法，將干燥好的抹片涂面向上，在火焰上來(lái)回通過(guò)數(shù)次（一般4～6次），以手背觸及玻片微燙手為宜。
(2)化學(xué)固定 有的血片、組織觸片用姬姆薩染色時(shí)，要用甲醇固定3～5min。
固定的目的是使菌體蛋白質(zhì)凝固，形態(tài)固定，易于著色，并且經(jīng)固定的菌體牢固黏附在玻片上，水洗時(shí)不易沖掉。
2、常用的細(xì)菌染色方法
美藍(lán)染色法 在經(jīng)火焰固定的抹片上，滴加適量美藍(lán)染色液覆蓋涂面，染色2～3min，水洗，晾干或吸水紙輕壓吸干鏡檢，結(jié)果，菌體呈藍(lán)色。
革蘭氏染色法
(1)在固定好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，染1～3min，水洗。
(2)加革蘭氏碘液媒染，作用1～2min，水洗。
(3)加95％酒精脫色約30s至1min，水洗。
(4)加稀釋石炭酸復(fù)紅或沙黃水溶液復(fù)染30s左右，水洗，吸干后鏡檢。
結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
瑞氏染色法 細(xì)菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定標(biāo)本，1～3min后，再滴加與染色液等量的磷酸鹽緩沖液或中性蒸餾水于玻片上，輕輕搖晃使與染色液混和均勻，5min左右水洗，干后鏡檢，菌體呈蘭色，組織細(xì)胞的胞漿將呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。
姬姆薩染色法 血片或組織觸片自然干燥后，用甲醇固定3～5min，干燥后在其上滴加足量染色液或?qū)⒛ㄆ胧⒂腥旧旱娜靖桌?，染?/font>30min，或者染色數(shù)小時(shí)或24h，取出水洗，吸干或烘干，鏡檢。細(xì)菌呈藍(lán)青色，組織細(xì)胞漿呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。
附 常用染色液的配制
1．堿性美藍(lán)染色液
甲液 美藍(lán) 0.3g，95％酒精 30ml
乙液 0.01％苛性鉀溶液 100ml
將美藍(lán)放入研缽中，徐徐加入酒精研磨均勻后即為甲液，將甲、乙兩液混和，越夜后用濾紙過(guò)濾即成。新配制的美藍(lán)染色不好，陳舊的染色好。
2．革蘭氏染色液
(1)草酸銨結(jié)晶紫染色液
甲液 結(jié)晶紫 2g，95%酒精 20ml
乙液 草酸銨 0.8g, 蒸餾水 80ml
將結(jié)晶紫放入研缽中，加酒精研磨均勻?yàn)榧滓?，然后將完全溶解的乙液與甲液混和即成。
(2)革蘭氏碘液(又稱(chēng)盧戈氏碘液) 碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml。將碘化鉀放入研缽中，加入少量蒸餾水使其溶解，再放入已磨碎的碘片徐徐加水，同時(shí)充分磨勻，待碘片完全溶解后，把余下的蒸餾水倒入，再裝入瓶中。
(3)稀釋石炭酸復(fù)紅溶液 取堿性復(fù)紅酒精飽和溶液(堿性復(fù)紅10g溶于95％酒精100ml中)1ml和5％石炭酸水溶液9ml混和，即為石炭酸復(fù)紅原液。再取復(fù)紅原液10ml和90ml蒸餾水混和，即成稀釋石炭酸復(fù)紅溶液。
3．瑞氏染色液 取瑞氏染料0.1g，純中性甘油1ml，在研缽中混和研磨，再加入甲醇60ml使其溶解，裝入棕色瓶中越夜，次日過(guò)濾，盛于棕色瓶中，保存于暗處。保存越久，染色越好。
4．姬姆薩染色液 取姬姆薩氏染料0.6g加于甘油50ml中，置55～60℃水浴中1.5～2h后，加入甲醇50ml，靜置1日以上，濾過(guò)即成姬姆薩染色原液。
臨染色前，于每毫升蒸餾水中加入上述原液1滴，即成姬姆薩染色液。應(yīng)當(dāng)注意，所用蒸餾水必須為中性或微堿性，若蒸餾水偏酸，可于每10ml左右加入1%碳酸鉀溶液1滴，使其變成微堿性。
第三個(gè)實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌形態(tài)觀察：
1、目的要求 能利用顯微鏡油鏡觀察細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)，并會(huì)進(jìn)行顯微鏡的保養(yǎng)。
2、儀器及材料 顯微鏡、香柏油、乙醇乙醚(替代二甲苯,乙醇與乙醚的比例為3∶7)、擦鏡紙、細(xì)菌染色標(biāo)本片。
3、方法與步驟
油鏡的識(shí)別 油鏡是接物鏡的一種，使用時(shí)需在物鏡和載玻片之間添加香柏油，因此稱(chēng)為油鏡?？筛鶕?jù)以下幾點(diǎn)識(shí)別。
1．一般來(lái)講，接物鏡的放大倍數(shù)越大，長(zhǎng)度就越長(zhǎng)，作為光學(xué)顯微鏡，油鏡的放大倍數(shù)最大，故油鏡最長(zhǎng)。
2．油鏡的放大倍數(shù)為90×或100×,使用時(shí)應(yīng)查看油鏡上標(biāo)明的倍數(shù)。
3．不同光學(xué)儀器廠生產(chǎn)的各類(lèi)顯微鏡，往往在接物鏡上有一白色色環(huán)作為油鏡的標(biāo)記，或直接在油鏡頭上標(biāo)有“油”字或“oil”字樣，有的標(biāo)有“HI”字樣。
油鏡的使用原理
主要避免部分光線折射的損失。因空氣的折光率(n=1.0)與玻璃的折光率(n=1.52)不同，故有一部分光線被折射，不能射入鏡頭，加之油鏡的鏡面較小，進(jìn)入鏡中的光線比低倍鏡、高倍鏡少得多，致使視野不明亮。為了增強(qiáng)視野的亮度，在鏡頭和載玻片之間滴加一些香柏油，因香柏油的折光率(n=1.515)和玻璃的相近。這樣絕大部分的光線能射入鏡頭，使視野明亮，物像清晰。
使用方法（以目前生產(chǎn)中使用較多的電光源顯微鏡為例）
1．放置 顯微鏡使用時(shí)應(yīng)放置在潔凈平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)桌或?qū)嶒?yàn)臺(tái)上。
2．調(diào)節(jié)視野亮度 打開(kāi)電源開(kāi)關(guān),盡量升高聚光器，放大光圈，調(diào)節(jié)亮度調(diào)節(jié)鈕，使射入鏡頭的光線適中（明亮但不刺眼睛）。
3．標(biāo)本片的放置 于標(biāo)本片的欲檢部位，滴加香柏油一滴，將標(biāo)本片固定于載物臺(tái)正中，用油鏡檢查。
4．鏡檢 首先，眼睛從鏡筒右側(cè)注視油鏡頭，小心轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使載物臺(tái)上升，直至油鏡頭浸沒(méi)油中，與玻片相接觸。然后，一面從目鏡觀察，一面徐徐轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使載物臺(tái)緩慢下降，待得到模糊物像時(shí)，再換用細(xì)調(diào)節(jié)器，直至物像完全清晰為止。
5．油鏡的保養(yǎng) 油鏡用畢，應(yīng)以擦鏡紙拭去鏡頭上的香柏油，如油已干或物鏡模糊不清，可滴加少量乙醇乙醚于擦鏡紙上，拭凈油鏡頭，并隨即用擦鏡紙拭去乙醇乙醚(以免乙醇乙醚溶解粘固鏡片的膠質(zhì)使其脫膠，致使鏡片移位或脫落)，然后，把低倍鏡轉(zhuǎn)至中央，高倍鏡和油鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，使載物臺(tái)和聚光器下降，關(guān)上電源,用綢布包好，放入鏡箱，存放于陰晾干燥處，避免受潮生銹。
應(yīng)該指出，目前所用的顯微鏡種類(lèi)很多，盡管油鏡的識(shí)別和原理是一致的，但在使用上與以上所述有不同，應(yīng)注意靈活掌握，目前生產(chǎn)中使用較多的是電光源顯微鏡。
細(xì)菌基本形態(tài)的觀察
1．純培養(yǎng)物標(biāo)本片(葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、炭疽桿菌等)
2．血片或組織觸片(炭疽桿菌、巴氏桿菌等)
第四個(gè)實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌分離
目的要求 能利用不同的被檢材料進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，觀察細(xì)菌的培養(yǎng)特性，并會(huì)進(jìn)一步移植培養(yǎng)。
儀器及材料
溫箱、病料、實(shí)驗(yàn)用菌種、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、肉渣湯(皰肉)培養(yǎng)基、接種環(huán)、酒精燈、烙刀、鑷子、剪子等。
方法與步驟
細(xì)菌的分離培養(yǎng)
1．平板劃線分離法
平板劃線是通過(guò)將被檢材料連續(xù)劃線而獲得單個(gè)菌落，因而劃線愈長(zhǎng)，獲得單個(gè)菌落的機(jī)會(huì)也愈多。具體操作步驟如下：
(1)右手持接種環(huán)于酒精燈上燒灼滅菌，待冷。
(2)無(wú)菌操作取病料 若為液體病料，可直接用滅菌的接種環(huán)取病料一環(huán)；若為固體病料，首先將烙刀在酒精燈上滅菌，并立即用其將病料表面燒烙滅菌，然后用滅菌接種環(huán)從燒烙部位插入組織中緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)接種環(huán)，取少量組織或液體。
(3)左手持平皿，用拇指、食指及中指將皿蓋打開(kāi)一側(cè)(角度大小以能順利劃線為宜，但以角度小為佳，以免空氣中細(xì)菌污染培養(yǎng)基)。
(4)將已取被檢材料的接種環(huán)伸入平皿，并涂于培養(yǎng)基一側(cè)，然后自涂抹處成30～40°角，以腕力在平板表面輕輕地分區(qū)劃線。
在細(xì)菌病診斷或藥敏試驗(yàn)時(shí)，為了提高效率，?？蓪⒚笊w放于酒精燈附近，左手持培養(yǎng)基，使劃線的平面與右側(cè)臺(tái)面的角度小于90°且在酒精燈附近，右手持接種環(huán)取病料連續(xù)劃線。
(5)劃線完畢，燒灼接種環(huán)，將培養(yǎng)皿蓋好，用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底部注明被檢材料及日期，倒置37℃溫箱中，培養(yǎng)18～24h觀察結(jié)果。凡是分離菌應(yīng)在劃線上生長(zhǎng)，否則為污染菌。
2．傾注分離法 取3支融化后冷至50℃左右的瓊脂管，用滅菌的接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)物(或被檢材料)移至第一管中，隨即用掌心搓轉(zhuǎn)均勻，再由第一管取一環(huán)至第二管，搓轉(zhuǎn)均勻后，再由第二管取一環(huán)至第三管經(jīng)同樣處理后，分別倒入三個(gè)滅菌培養(yǎng)皿中，待凝固后，倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。
厭氧菌的分離培養(yǎng)
厭氧菌的分離培養(yǎng)常用肉渣湯(皰肉培養(yǎng)基)培養(yǎng)法。先將試管傾斜，使培養(yǎng)基表面露出一點(diǎn)，然后接種被檢材料或菌種，接種后將試管直立，即封閉液面。最后置37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h。
細(xì)菌移植
1．斜面移植
(1)左手持菌種管及瓊脂斜面管，一般菌種管放在外側(cè)，斜面管放在內(nèi)側(cè)，兩管口并齊，管身略?xún)A斜，斜面向上，管口靠近火焰。
(2)右手拇指、食指及中指持接種環(huán)在酒精燈上燒灼滅菌。
(3)將斜面管的棉塞夾在右手掌心與小指之間，菌種管棉塞夾在小指與無(wú)名指之間，將二棉塞一起拔出。
(4)把滅菌接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，挑取少量菌苔將其立即伸入斜面培養(yǎng)基底部，由下而上在斜面上彎曲劃線，然后管口和棉塞通過(guò)火焰后塞好，接種環(huán)燒灼滅菌。
(5)在斜面管口，寫(xiě)明菌種名，日期，置37℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24h，觀察生長(zhǎng)情況。
2．肉湯移植 方法同上，取少許菌落，迅速伸入肉湯管內(nèi)，在接近液面的管壁輕輕研磨，并蘸取少許肉湯調(diào)和，使菌混和于肉湯中。
3．從平板移植到斜面 無(wú)菌操作打開(kāi)平皿蓋，挑取少許菌落移于斜面管，方法同上。
4．半固體培養(yǎng)基穿刺接種法 方法基本同斜面移植，但用接種針挑取菌落，由培養(yǎng)基表面中心垂直刺入管底，然后由原線退出接種針。
細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)特性的觀察
1．瓊脂平板培養(yǎng)基 主要觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基上形成的菌落的特征。
(1)大小 以直徑(mm)表示，小菌落如針尖大，大菌落為5～6mm，甚至更大。
(2)形狀 有圓形、不規(guī)則形、針尖狀、露滴狀、同心圓形、根足形等。
(3)邊緣 有整齊、波浪狀、鋸齒狀、卷發(fā)狀等。
(4)表面形狀 光滑、粗糙、同心圓狀、放射狀、皺狀、顆粒狀等。
(5)濕潤(rùn)度 濕潤(rùn)、干燥。
(6)隆起度 表面隆起、輕度隆起、中央隆起、臍狀、扣狀、扁平狀。
(7)色澤和透明度 色澤有無(wú)色、白、黃、橙、紅等；透明度有透明、半透明、不透明等。
(8)質(zhì)地 分堅(jiān)硬、柔軟或黏稠等。
(9)溶血性 菌落周?chē)袩o(wú)溶血環(huán)。有透明的溶血環(huán)稱(chēng)β型溶血；呈很小的半透明綠色的溶血環(huán)稱(chēng)α型溶血；不溶血的為γ型溶血。
2．肉湯培養(yǎng)基：
(1)渾濁度 有高度渾濁、輕微渾濁或仍保持透明者。
(2)沉淀 管底有無(wú)沉淀，沉淀物是顆粒狀或棉絮狀等。
(3)表面 液面有無(wú)菌膜，管壁有無(wú)菌環(huán)。
(4)色澤 液體是否變色，如綠色、紅色等。
3．半固體培養(yǎng)基 具有鞭毛的細(xì)菌，沿穿刺線向周?chē)鷶U(kuò)散生長(zhǎng)，無(wú)鞭毛的細(xì)菌沿穿刺線呈線狀生長(zhǎng)。
第五個(gè)實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)
儀器及材料 溫箱、接種環(huán)、酒精燈、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、醋酸鉛蛋白胨水培養(yǎng)基、檸檬酸鹽瓊脂斜面培養(yǎng)基、MR試劑、VP試劑、靛基質(zhì)試劑
方法與步驟
細(xì)菌都有各自的酶系統(tǒng)，因此，都有各自的分解與合成代謝產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物就是鑒別細(xì)菌的依據(jù)。所謂細(xì)菌的生化試驗(yàn)，就是用生物化學(xué)的方法檢查細(xì)菌的代謝產(chǎn)物。以下是幾種常用的生化試驗(yàn)：
糖發(fā)酵試驗(yàn) 有些細(xì)菌能分解糖產(chǎn)酸，從而使指示劑變色。試驗(yàn)時(shí)，將細(xì)菌無(wú)菌操作接種于糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24～48h，結(jié)果有三種：有的只產(chǎn)酸(＋)，有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣(⊕)，有的不發(fā)酵(-)。
甲基紅(MR)試驗(yàn)與維－培(VP)試驗(yàn) 取菌接種于2支含0.5%葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃溫箱培養(yǎng)4d，分別作甲基紅和維－培試驗(yàn)。
1．甲基紅試驗(yàn) 取上述培養(yǎng)基一支，加入甲基紅試劑(甲基紅0.1g溶于95%酒精300ml中)5～6滴，液體呈紅色者為陽(yáng)性，黃色者為陰性，橙色者為可疑。
2．維－培試驗(yàn) 取上述培養(yǎng)基一支，先加維－培甲液(6%α－甲萘酚酒精溶液)3ml，再加入維－培乙液(40%氫氧化鉀水溶液)1ml，混和后靜置于試管架內(nèi)觀察2～4h，凡液體呈紅色者為陽(yáng)性，不變色者為陰性。
靛基質(zhì)試驗(yàn) 有些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)(吲哚)，遇相應(yīng)試劑而呈紅色。試驗(yàn)時(shí)，取菌接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2～3d；于培養(yǎng)基中加入戊二醇或二甲苯2～3ml，搖均，靜置片刻后，沿試管壁加入靛基質(zhì)試劑(配法：對(duì)二甲基氨基苯甲醛1.0g，95%酒精95ml溶解后，再加濃鹽酸50ml)2ml，若能形成玫瑰靛基質(zhì)而呈紅色，則為陽(yáng)性反應(yīng)，不變色為陰性反應(yīng)。
硫化氫試驗(yàn) 某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸如半胱氨酸等產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇醋酸鉛或硫酸亞鐵則形成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵。用接種針取菌穿刺于含有醋酸鉛或硫酸亞鐵的瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4d，凡沿穿刺線或穿刺線周?chē)屎谏邽殛?yáng)性，不變色者為陰性。
檸檬酸鹽利用試驗(yàn) 取菌接種于檸檬酸鹽瓊脂斜面上，置37℃培養(yǎng)4d，如果有細(xì)菌生長(zhǎng)，使培養(yǎng)基變藍(lán)色，則為陽(yáng)性，否則為陰性。
第六個(gè)實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)
目的要求
掌握?qǐng)A紙片擴(kuò)散法測(cè)定細(xì)菌對(duì)抗生素等藥物的敏感試驗(yàn)的操作方法和結(jié)果判定，明確藥敏試驗(yàn)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。
儀器及材料
接種環(huán)、酒精燈、試管架、眼科鑷子、溫箱、普通瓊脂平板、抗菌藥物紙片、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物。
方法與步驟
1．無(wú)菌操作，取細(xì)菌培養(yǎng)物，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上密集均勻劃線。
2．用無(wú)菌鑷子夾取各種抗菌藥物圓紙片（一般在試紙片上標(biāo)記有藥物名或代號(hào)），輕輕貼在已接種細(xì)菌的瓊脂培養(yǎng)基表面，一次放好，不能移動(dòng)，各紙片間的距離要大致相等。
3．平皿倒置，37℃溫箱中培養(yǎng)18～24h。
4．結(jié)果觀察。根據(jù)紙片周?chē)袩o(wú)抑菌圈及其直徑大小，確定細(xì)菌對(duì)抗生素等藥物的敏感度。
二、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）：
目的要求
掌握ELISA的基本操作步驟，了解豬群豬瘟等抗體監(jiān)測(cè)的意義。
儀器及材料 酶聯(lián)檢測(cè)儀、酶標(biāo)板、微量加樣器(配帶槍頭)、病毒抗原、酶標(biāo)SPA、陽(yáng)性血清、陰性血清、待檢血清、pH9.6碳酸鹽緩沖液、洗滌液（PBS-T）、BSA(牛血清白蛋白)、封閉液、稀釋液、底物溶液、30%H2O2、2mol/L H2SO4溶液、鄰苯二胺（OPD）。
方法與步驟
1．包被
用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋病毒抗原至1μg/ml，以微量加樣器每孔加樣100μl，置濕盒內(nèi)37℃包被2～3h。
2．洗滌
用洗滌液（PBS-T）將反應(yīng)板洗滌三次，每次5min，甩干。
3．封閉 以微量加樣器在每孔內(nèi)加封閉液200μl，置濕盒內(nèi)37℃封閉3h。
4．洗滌
重復(fù)第2步。
5．加待檢血清 以微量加樣器在每孔內(nèi)加100μl稀釋液，然后在酶標(biāo)板的第1孔加100μl待檢血清，以微量加樣器反復(fù)吹吸幾次混勻后，吸100μl加至第2孔，依次倍比稀釋至第12孔，剩余的100μl棄去，置濕盒內(nèi)37℃作用2h。
6．洗滌
重復(fù)第2步。
7．加酶標(biāo)SPA
以稀釋液將酶標(biāo)SPA稀釋至工作濃度，以微量加樣器每孔加100μl，置濕盒內(nèi)37℃作用2h。
8．洗滌 重復(fù)第2步。
9．加底物溶液顯色 每孔加入新配制的底物溶液100μl，37℃避光顯色10min。
10．終止反應(yīng) 加2mol/LH2SO4溶液終止反應(yīng)，每孔50μl。
11．結(jié)果判定 以酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品的A490，檢測(cè)之前，先以空白孔調(diào)零，當(dāng)P/N≥2.1即判為陽(yáng)性。
注意：每塊ELISA板均需在最后一排的后3孔設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。
附：常用試劑的配制
1.包被液(0.05molpH9.6碳酸鹽緩沖液)：Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 蒸餾水 1000ml。
2.緩沖液（0.01molpH7.4 PBS）：NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4 2.9g；KCl 0.2g；蒸餾水 1000ml。
3.洗滌液（0.01molpH7.4PBS-吐溫20）：Tween-20 0.5ml；0.01M pH7.4 PBS；1000ml。
4.封閉液（1%BSA-PBS-T）：BSA 1.0g；PBS-T 100ml。
5.底物緩沖液（pH5.0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液）：檸檬酸 4.6656g；Na2HPO4 7.2988g；蒸餾水 1000ml。
6.底物溶液（臨用前新鮮配制，配后立即使用）：鄰苯二胺(OPD) 40mg；30%H2O2 0.15ml；底物緩沖液 100ml。
7.終止劑（2mol/LH2SO4）：H2 SO4 22.2ml；蒸餾水 177.8ml。
三 其他必須配備的實(shí)驗(yàn)室基本儀器物品：
離心機(jī) 1臺(tái)
水浴鍋
1臺(tái)
玻璃勻漿器
若干
試驗(yàn)臺(tái) 1套
空調(diào)
1臺(tái)
實(shí)驗(yàn)用水龍頭和水池
2個(gè)
洗滌用毛刷
包扎用牛皮紙、繩子
四 獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的基本功能及以后的發(fā)展方向建議：
1、主要開(kāi)展以下工作：
（１）
抗體監(jiān)測(cè)：
根據(jù)各豬場(chǎng)豬群健康狀況，定期進(jìn)行 HCV、PR 、 PRRS等和各類(lèi)病原菌抗體檢測(cè)和病理分析，指導(dǎo)豬場(chǎng)做好防治工作；疫苗質(zhì)量的監(jiān)控；對(duì)豬的重要傳染病的抗體監(jiān)測(cè)和病理分析。
目的：通過(guò)以上各項(xiàng)工作，摸清各豬場(chǎng)的疫病流行情況和免疫狀況，為制定我公司豬場(chǎng)免疫程序提供了科學(xué)依據(jù)。
（２）
病毒性疾病的基因診斷：
利用PCR、RT-PCR技術(shù)，對(duì)于發(fā)病豬進(jìn)行病毒的基因診斷，摸清各豬場(chǎng)HCV、PRRS、PCV和PRV等重要致病病毒的存在和分布情況，以便有針對(duì)性地做清除或凈化策略。
（３）
開(kāi)展細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定和藥敏試驗(yàn)工作
從血液或病料中分離出病原菌，通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)純化、顯微鏡觀察和生化實(shí)驗(yàn)鑒定病原菌的類(lèi)型，通過(guò)藥敏試驗(yàn)找到最為敏感的抗菌素，提高治療效果，減少無(wú)效用藥。另外，可以從豬場(chǎng)發(fā)病豬分離到病原菌并保存，用于測(cè)試我豬場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)藥品的有效性。
（４）
制作高免血清
利用豬場(chǎng)淘汰的母豬或育肥豬，分別注射大劑量的各種主要疫苗和自家疫苗，之后無(wú)菌采血離心分離血清，滅活并進(jìn)行安全檢查后制成高質(zhì)量的治療用血清用于臨床疾病預(yù)防和治療，保護(hù)窗口期的小豬（保育豬）免受病毒和病菌感染；減少藥物的使用；生產(chǎn)安全、衛(wèi)生、無(wú)藥物殘留的優(yōu)質(zhì)豬肉。
（５）
每年一次進(jìn)行豬場(chǎng)寄生蟲(chóng)病普查，根據(jù)普查結(jié)果制定驅(qū)蟲(chóng)方案
豬場(chǎng)主要存在的寄生蟲(chóng)有蛔蟲(chóng)、結(jié)節(jié)蟲(chóng)、球蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)和小袋蟲(chóng)等，通過(guò)針對(duì)性的預(yù)防，上述蟲(chóng)體可得到很好控制，感染率可得到明顯降低。
（６）
配制豬場(chǎng)常用的一些藥品試劑
電解質(zhì)補(bǔ)液鹽、葡萄糖注射液、疫苗稀釋液、生理鹽水、碘酒和紫藥水等，這些在豬場(chǎng)大量應(yīng)用，在實(shí)驗(yàn)室也易于配置生產(chǎn)，可大大降低豬場(chǎng)的生產(chǎn)成本
2、
效益分析：
（１）
通過(guò)為自己公司各豬場(chǎng)做各種大規(guī)模的、可重復(fù)性的診斷，可大大提高診斷的準(zhǔn)確性和可靠性，特別值得一提的是，診斷費(fèi)用可大大降低，自己檢測(cè)只需成本費(fèi)用，僅為在別的公司檢測(cè)的所需費(fèi)用的20-30%
（２）
通過(guò)對(duì)病毒病的流行病學(xué)調(diào)查，制作高質(zhì)量的、高抗體滴度的、可靠的高免血清用于處于窗口期保育仔豬的疾病預(yù)防和病豬的治療，細(xì)菌分離鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)，抗體檢測(cè)和疫苗效果評(píng)估，間接地、積極主動(dòng)地參與到豬場(chǎng)的生產(chǎn)指導(dǎo)中來(lái)，在保障豬群健康安全狀況中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
（３）
可以大規(guī)模生產(chǎn)一些易于制作的而豬場(chǎng)又用量很大的藥品制劑，如電解質(zhì)補(bǔ)液鹽、葡萄糖注射液、疫苗稀釋液、生理鹽水、碘酒和紫藥水等，可以大大降低豬場(chǎng)生產(chǎn)成本；通過(guò)科學(xué)指導(dǎo)用藥，血清可以減少藥品的使用，提高治療的效果。自家疫苗可以提高免疫效果，特別對(duì)于一些尚無(wú)有效疫苗或免疫不理想的傳染病。
綜合上述，獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的建立可以大大降低豬場(chǎng)的生產(chǎn)費(fèi)用，間接地參與到豬場(chǎng)生產(chǎn)指導(dǎo)中來(lái)，其重要性不可低估。
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發(fā)表于 2008-1-21 18:40:03
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