川楝素妊娠毒性作用與孕鼠INF-γ、TNF-α含量的相關(guān)性研究

魁罡

川楝素妊娠毒性作用與孕鼠INF-γ、TNF-α含量的相關(guān)性研究

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張建樓　鐘秀會(huì)　史萬(wàn)玉　馬愛(ài)團(tuán) (河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071001) 　　長(zhǎng)期以來(lái)，農(nóng)藥殘留對(duì)于公眾健康的危害是以引起癌變作為指標(biāo)。近年來(lái)由于農(nóng)藥殘留對(duì)生殖和發(fā)育危害的后果突出，被認(rèn)為可能是造成不孕、流產(chǎn)、功能異常和畸形等因素之一。有研究表明動(dòng)物生殖和胚胎發(fā)育過(guò)程對(duì)農(nóng)藥毒物似乎更加敏感。因此，農(nóng)藥對(duì)生殖和發(fā)育的危害及其后果的分析成為生殖和發(fā)育毒物學(xué)中重要的研究?jī)?nèi)容，并逐漸進(jìn)入各國(guó)的食品常規(guī)分析和檢測(cè)項(xiàng)目中。川楝素(Toosendain)是從傳統(tǒng)驅(qū)蛔中藥楝屬植物川楝樹(shù)或苦楝樹(shù)的根皮苦楝（Melia azedarach L）皮、川楝（Melia Toosendain Sieb.et Zucc）子中提取的一種四環(huán)三萜類(lèi)化合物[1,2]。最早于1953年由四川省中藥研究所提取，主要用來(lái)驅(qū)蟲(chóng)，近年來(lái)也用于農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)[3]。關(guān)于楝樹(shù)的殺蟲(chóng)作用，歷史上有不少記載，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記有楝樹(shù)“殺三蟲(chóng)”。蘇東坡所著《格物粗談》中記載，“收苦楝花或葉藏席下可避蚤虱”，“端午取楝子碎投廁中不生蟲(chóng)”。已有研究表明，一定劑量的川楝素能使小鼠完全流產(chǎn)[4]?，F(xiàn)在川楝素多用于蔬菜、瓜果的殺蟲(chóng)，其在蔬菜、瓜果上殘留的是否對(duì)人類(lèi)尤其是孕婦有潛在的影響呢？研究川楝素對(duì)動(dòng)物的生殖毒性作用和機(jī)理，以及劑量和效應(yīng)關(guān)系，對(duì)于豐富中藥藥理學(xué)內(nèi)容，保證川楝素作為農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑的安全使用，有著重要的意義。 　　1　材料和方法 　　1.1試驗(yàn)動(dòng)物 　　10周齡未經(jīng)產(chǎn)純種BALB/c系小鼠（清潔級(jí)），購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)。常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食。日光照12h。經(jīng)適應(yīng)環(huán)境1周后，眼觀檢查結(jié)合陰道涂片法進(jìn)行發(fā)情鑒定。陰道涂片經(jīng)姬姆薩染色，鏡下觀察全部為無(wú)核角化上皮細(xì)胞定位發(fā)情。發(fā)情母鼠與公鼠1：1合籠過(guò)夜，于次日清晨，見(jiàn)有陰栓者定位孕0d。 　　1.2試驗(yàn)藥品及配制 　　川楝素提取物（含量90%），購(gòu)自深圳市倬源實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，用10%丙二醇生理鹽水（經(jīng)細(xì)菌濾器過(guò)濾消毒）稀釋成20μg/mL。 小鼠TNF-α、INF-γ ELISA試劑盒，R＆D Systems明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州，美國(guó)，購(gòu)自晶美生物公司。 　　1.3試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 　　試驗(yàn)分5組。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腹腔注射10%丙二醇生理鹽水對(duì)孕鼠的妊娠沒(méi)有影響。A組在孕5、6、7d時(shí)腹腔注射10%丙二醇生理鹽水。川楝素對(duì)小鼠的腹腔注射LD50是13.8mg/kg[4]，B、C、D、E組孕鼠在孕5、6、7d時(shí)分別腹腔注射川楝素溶液1/60 LD50、1/30 LD50、1/20 LD50、1/15 LD50。注射前用天平稱取每只小鼠的體重，計(jì)算注射劑量。于孕8d眼球采血處死小鼠，取上清，用于測(cè)定血液中細(xì)胞因子的含量；取右側(cè)子宮勻漿，測(cè)定細(xì)胞因子的含量。 　　1.4流產(chǎn)判定及胚胎吸收率、流產(chǎn)率的計(jì)算 胚胎體積變小、顏色紫黑、出血壞死、呈血團(tuán)狀、鏡檢無(wú)胎膜結(jié)構(gòu)為胚胎吸收或死亡。胚胎個(gè)體大，粉紅色，鏡檢胎膜及胎兒輪廓清晰，無(wú)出血、淤血者為正常胚胎。按下列公式[5]計(jì)算試驗(yàn)各組的流產(chǎn)率和胚胎吸收率。 　　流產(chǎn)率=發(fā)生流產(chǎn)的母鼠數(shù)/試驗(yàn)組母鼠總數(shù)×100% 　　胚胎死亡（吸收）率=死亡胚胎數(shù)/（死亡胚胎數(shù)+正常胚胎數(shù)）×100% 　　1.5TNF-α、INF-γ的測(cè)定 　　眼球采血，12000r/m，4℃離心10min,取上清液分裝備用。取右側(cè)子宮，剪除子宮系膜及脂肪，縱向切開(kāi)子宮，剝?nèi)ヌ?，剪碎子宮角，加入6倍于子宮質(zhì)量的含有PMSF（蛋白酶抑制劑0.75μg/mL）的PBS（pH7.4）。在冰水環(huán)境中立即進(jìn)行勻漿，12000r/m, 4℃，離心15min，取上清液分裝，-80℃凍存待檢。TNF-α、INF-γ的測(cè)定均按試劑盒說(shuō)明操作。加終止液后即刻在318MC型酶標(biāo)分析儀(上海三科儀器有限公司)450nm處讀取OD值，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各細(xì)胞因子含量。 　　1.6統(tǒng)計(jì)方法 　　使用Excel 2000和SPASS12軟件包,以單變量方差分析和卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。 　　2　結(jié)果 　　2.1川楝素溶液致早期孕鼠流產(chǎn)的效果 　　對(duì)照組A組本身有一定的自然流產(chǎn)率14.29%，胚胎吸收率13.04%；B組流產(chǎn)率50.00%，與A組相比較，流產(chǎn)率差異不顯著（P>0.05），胚胎吸收率為42.59%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）；C組流產(chǎn)率為 62.5%，與A組比較差異顯著（P<0.05），胚胎吸收率為46.55%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）；D組流產(chǎn)率為 75.00%，與A組比較差異顯著（P<0.05），胚胎吸收率為70.37%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）；E組流產(chǎn)率為 89.89%，與A組比較差異極顯著（P<0.01），胚胎吸收率為73.77%，與A組比較差異極顯著（P<0.01）。胚胎吸收率B組與D、E組比較差異極顯著P<0.01）；C組與D組比較差異顯著（P<0.05），與E組比較差異極顯著（P<0.01）；D、E組間差異不顯著（P>0.05）。B、C、D、E各組之間流產(chǎn)率差異不顯著（P>0.05）。詳見(jiàn)表1。 　　表1　不同劑量川楝素的流產(chǎn)效果 組別 roup 流產(chǎn)率(%) Abortion rate(%) 胚胎吸收比率(%) Rate of embryo resorption(%) A對(duì)照組 14.29%(1/7) cdE 13.04%(6/46)BCDE B組 1/60LD50川楝素注射液 50.00%(4/8) 42.59%(23/54)ADE C組1/30LD50川楝素注射液 62.50%(5/8)a 46.55%(17/58)AdE D組1/20LD50川楝素注射液 75.00%(6/8)a 70.37%(38/54)ABc E組1/15LD50川楝素注射液 88.89%(8/9)A 73.33%(44/60)ABC 　　注：小寫(xiě)字母不同表示差異顯著（P<0.05）,大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著（P<0.01），以下同。 　　2.2血清和子宮組織中TNF-α測(cè)定結(jié)果 　　川楝素可以提高血清和子宮組織中TNF-α的含量。B組注射1/60 LD50的川楝素溶液，TNF-α在子宮組中含量為1893.378±61.236pg/g蛋白，顯著高于對(duì)照組A組（P<0.05），在血清中含量為31.938±9.827 pg/mL，顯著高于對(duì)照組A組（P<0.05）；C組注射1/30 LD50的川楝素溶液， INF-γ在子宮組織中含量為2263.128±281.934pg/g蛋白，極顯著高于對(duì)照組A組（P<0.01），血清中含量為55.979±29.753 pg/mL，極顯著高于對(duì)照組A組（P<0.01）；D組注射1/20 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為2008.374±175.374pg/g蛋白，極顯著高于對(duì)照組A組（P<0.01），血清中含量為43.438±14.965 pg/mL，極顯著高于對(duì)照組A組（P<0.01）；E組注射1/15 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為1997.436±271.146pg/g蛋白，極顯著高于對(duì)照組A組（P<0.01），血清中含量為32.688±11.264 pg/mL，顯著高于對(duì)照組A組（P<0.05）。子宮組織中INF-γ含量C組與B組比較差異顯著（P<0.05），血清中的INF-γ含量C組與B組、E組比較差異顯著（P<0.05）。詳見(jiàn)表2。 　　表2　各處理組血清和子宮組織中TNF-α的含量 組別 Group 血清(pg/mL) Blood sperum (pg/mL) 子宮組織（pg/g） Uterus tissue (pg/g) A對(duì)照組 3.729±0.144bCDe 1439.628±163.074bCDE B組1/60LD50川楝素注射液 31.938±9.827ad 1893.378±61.236ac C組1/30LD50川楝素注射液 55.979±29.753Abe 2263.128±281.934Ab D組1/20LD50川楝素注射液 43.438±14.965A 2008.374±175.374A E組1/15LD50川楝素注射液 32.688±11.264ad 1997.436±271.146 A 　　2.3血清和子宮組織中INF-γ測(cè)定結(jié)果 　　川楝素可以提高血清和子宮組織中INF-γ的含量。B組注射1/60 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮組中含量為3724.998±421.212pg/g蛋白，顯著高于對(duì)照組A組（P<0.05），在血清中含量為42.656±15.118pg/ pg/mL，極顯著高于對(duì)照組A組（P<0.01）；C組注射1/30 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮組織中含量為4182.402±608.154pg/g蛋白，極顯著高于對(duì)照組A組（P<0.01），血清中含量為56.250±22.991 pg/mL，極顯著高于對(duì)照組A組（P<0.01）；D組注射1/20 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為3805.002±243.864pg/g蛋白，顯著高于對(duì)照組A組（P<0.05），血清中含量為37.813±10.7892 pg/mL，顯著高于對(duì)照組A組（P<0.05）；E組注射1/15 LD50的川楝素溶液，INF-γ在子宮中的含量為3633.600±374.568pg/g蛋白，顯著高于對(duì)照組A組（P<0.05），血清中含量為34.219±8.646 pg/mL，極顯著高于對(duì)照組A組（P<0.01）。INF-γ在子宮組織中的含量各實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著（P>0.05）；血清中的INF-γ含量C組與B組比較差異不顯著（P>0.05），與D組相比較差異顯著（P<0.05），與E組比較差異極顯著（P<0.01）。詳見(jiàn)表3。 表3　各處理組血清和子宮組織中INF-γ的含量 組別 Group 血清(pg/mL) Blood sperum (pg/mL) 子宮組織（pg/g） Uterus tissue (pg/g) A對(duì)照組 6.000±0.354BCde 2743.998±169.704bCde B組1/60LD50川楝素注射液 42.656±15.118A 3724.998±421.212a C組1/30LD50川楝素注射液 56.250±22.991AdE 4182.402±608.154A D組1/20LD50川楝素注射液 37.813±10.7892ac 3805.002±243.864a E組1/15LD50川楝素注射液 34.219±8.646aC 3633.600±374.568a 　　3.討論 　　孕8d剖檢，1/30LD50的劑量使孕鼠達(dá)到62.5%的流產(chǎn)率，與對(duì)照組比較差異顯著。1/20LD50、1/15LD50川楝素溶液由于導(dǎo)致75%、88.89%流產(chǎn)，因此劑量偏大，不適合做流產(chǎn)模型；而1/60LD50的流產(chǎn)率又偏小，1/30LD50的劑量使流產(chǎn)率達(dá)到62.5%，又有一定的成活的胚胎，與對(duì)照組比較顯著差異（詳見(jiàn)表1）。因此，1/30LD50的川楝素溶液流產(chǎn)效果比較理想，所以選擇1/30LD50為川楝素致流產(chǎn)的最佳劑量。 　　川楝素本身有一定的毒性。腹腔注射大劑量川楝素可引起急性中毒，主要致死原因是由于血管壁通透性增加，引起內(nèi)臟出血，血壓下降而形成急性循環(huán)衰竭。張先福研究表明[4]，給妊娠早期母鼠腹腔注射最大劑量不到1/10的LD50（13.8mg/kg）川楝素，就會(huì)使胚胎異常，產(chǎn)生毒性作用。本研究給孕5d的小鼠連續(xù)3d腹腔注射川楝素溶液，通過(guò)解剖發(fā)現(xiàn)，具有子宮出血、子宮水腫，胚胎死亡的孕鼠數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）說(shuō)明川楝素的致流產(chǎn)作用明顯，與前人的工作是相吻合的。由本研究結(jié)果可以看出，給孕5d的小鼠注射川楝素溶液后，TNF-α、IFN-γ的含量顯著增加，說(shuō)明川楝素可以促進(jìn)Th1細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌。 　　本試驗(yàn)結(jié)果表明，孕5d小鼠注射不同劑量的川楝素溶液后，在導(dǎo)致流產(chǎn)的同時(shí)TNF-α、IFN-γ的含量升高。TNF-α和IFN-γ都屬于Th1型細(xì)胞因子。近年來(lái)，普遍認(rèn)為早期胚胎丟失與子宮免疫環(huán)境有密切關(guān)系，提出白介素-2（Interferon-2,IL-2）、腫瘤壞死因子（Tumour necrosis factor,TNF）,以及γ-干擾素（Interferon-γ）等可導(dǎo)致胚胎死亡[6]。 　　TNF-α主要由Th1細(xì)胞分泌，活化NK細(xì)胞和肥大細(xì)胞也分泌一部分[7]。TNF-α導(dǎo)致流產(chǎn)已被動(dòng)物試驗(yàn)所證實(shí)。Gendron等報(bào)道，LPS誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)與子宮內(nèi)的TNF-α增多有直接關(guān)系[8]。將人工重組TNF-α直接注入孕鼠體內(nèi)，亦可引起流產(chǎn)[9]。同時(shí)，TNF-α能抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞DNA合成及增生。TNF-α為重要的炎癥介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子，是造成胎盤(pán)壞死的終末介導(dǎo)物之一。 TNF-α對(duì)生殖過(guò)程有重要影響[10,11 ],在小鼠的懷孕期被嚴(yán)格地控制著[12] 。TNF-α異常對(duì)妊娠時(shí)胚胎存活是有害的[13]，母體TNF-α可能影響囊胚生長(zhǎng)和著床[14,15] 　　TNF-α在黃體形成期起著重要的調(diào)節(jié)作用，抑制胚泡著床[16]。TNF-α能誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胎盤(pán)血管血栓形成，誘發(fā)宮縮使著床的胚胎壞死、排出。TNF-α與IL-2共同作用還可使NK細(xì)胞活化，損害胎盤(pán)組織。TNF-α參與抗體依賴細(xì)胞毒作用，并使前列腺素增多導(dǎo)致流產(chǎn)[17]。但是大量資料表明，正常妊娠期間適量TNF-α能促進(jìn)分解代謝，從而滿足胎兒的營(yíng)養(yǎng)需要，對(duì)其他細(xì)胞因子及黏附分子的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)作用，在維持正常妊娠的順利進(jìn)行中必不可少，參與了妊娠期間免疫平衡的建立和穩(wěn)定[18]。 　　IFN-γ主要來(lái)自活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞及絨毛間質(zhì)霍夫包爾氏細(xì)胞， IFN-γ通過(guò)誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）-Ⅱ類(lèi)抗原表達(dá)，參與抗原遞呈和特異性免疫識(shí)別過(guò)程[19]。原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)患者血清中平均IFN-γ含量明顯高于正常對(duì)照組（P﹤0.05）[20]。試驗(yàn)證明，一定濃度范圍的IFN-γ（10~1000ng/mL）可明顯抑制絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞活性及其hCG分泌，其抑制作用呈劑量依賴性[21]。IFN-γ/IL-4可能通過(guò)影響胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞活性及hCG分泌而在早期妊娠中起重要的免疫調(diào)節(jié)作用[22]。由此可以說(shuō)明，IFN-γ濃度的升高伴隨著hCG分泌量得降低，從而不利于妊娠的進(jìn)行。曹永清等人發(fā)現(xiàn)人重組IFN-γ對(duì)人子宮蛻膜組織蛋白的合成呈抑制作用，給孕兔注射導(dǎo)致胚泡著床率降低80%左右。IFN-γ能夠活化Mφ,使其具有抗原遞呈能力，此種作用可以被IL-10抑制[23]。體外試驗(yàn)證明，IFN-γ抑制滋養(yǎng)層的生長(zhǎng)，IFN-γ與INF-α協(xié)同作用可抑制胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，上調(diào)胚胎MHC-I類(lèi)抗原的表達(dá)，IL-2誘導(dǎo)蛻膜NK樣細(xì)胞增殖并使其轉(zhuǎn)化為具有殺傷滋養(yǎng)層細(xì)胞的表型。Th1型細(xì)胞因子可能通過(guò)激活NK細(xì)胞與LAK細(xì)胞而作用于胎兒胎盤(pán)組織，導(dǎo)致妊娠失敗[24]。白血病抑制因子（LIF）和IFN-γ都是由母胎界面的細(xì)胞和組織所分泌，LIF促進(jìn)胚胎的著床有利于妊娠的進(jìn)行，IFN-γ卻不利于妊娠[25]。 　　本試驗(yàn)結(jié)果表明，苦楝皮及其單體成分川楝素能導(dǎo)致孕鼠流產(chǎn)，使子宮內(nèi)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α含量升高，從而打破了母胎界面Th1/Th2的平衡，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。 　　參考文獻(xiàn) [1].Patrick J,Lindstrom JM. 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