半胱胺鹽酸鹽對仔豬的影響

czy89497 · 發(fā)表于 2008-4-29 16:54:08

文章來源：山東畜牧網(wǎng)

更新時(shí)間：2008-4-11 14:59:55

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　　半胱胺鹽酸鹽對仔豬胃黏膜細(xì)胞H+-K+-ATPase活性和生長抑素表達(dá)的影響　　(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京210095) 　　胃酸分泌是由胃組織中壁細(xì)胞來完成的,H+-K+-ATP酶(H+-K+-ATPase),又名質(zhì)子泵,在胃酸分泌過程中起著關(guān)鍵作用。它通過自身磷酸化和去磷酸化,將細(xì)胞外液中的K+轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi),同時(shí)逆濃度梯度將細(xì)胞內(nèi)的H+泵出細(xì)胞外,完成H+/K+電中性跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)和胃酸分泌功能。H +-K+-ATPase專一性的存在于壁細(xì)胞中,H+-K+-ATPase的活性增強(qiáng),胃酸分泌能力也相應(yīng)增加,反之則相反。目前人們常以胃液的pH來判斷胃的泌酸功能,但由于胃液的酸度受到食糜和胃其他分泌物的影響,這個(gè)指標(biāo)并不能完全反映胃自身泌酸能力的強(qiáng)弱。因此,H+-K+-ATPase不僅可以更精確客觀地衡量胃酸分泌能力,同時(shí)也是所有胃酸分泌調(diào)控途徑的最后作用靶點(diǎn)。在人醫(yī)臨床上已開發(fā)了許多抑制H+-K+-ATPase活性的藥物,如奧美啦唑、蘭嗦啦唑等,用來治療胃酸分泌過多癥,而對增強(qiáng)H+-K+-ATPase活性的藥物研究相對較少。仔豬腹瀉給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失,而胃酸分泌不足是導(dǎo)致仔豬腹瀉的重要原因,如何有效地促進(jìn)胃酸分泌是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。　　半胱胺(cysteamine,CS)是生長抑素(somatostatin,SS)的耗竭劑,它通過破壞SS半胱氨酸殘基上的二硫鍵,使SS 生物活性和免疫活性喪失,從而解除SS對胃酸分泌的抑制作用,促進(jìn)胃酸分泌。盡管已有很多關(guān)于CS的報(bào)道,但在畜牧上大多集中在CS的促生長作用上,而 CS對仔豬胃酸分泌調(diào)節(jié)的研究尚未見報(bào)道。在人醫(yī)臨床上CS對胃酸分泌調(diào)節(jié)的研究大多以鼠為動物模型,并且以整體實(shí)驗(yàn)為主,而體外研究的報(bào)道較少。在整體情況下,影響胃酸分泌的神經(jīng)體液因素很多并且很復(fù)雜,而體外條件下細(xì)胞不受體內(nèi)復(fù)雜內(nèi)環(huán)境的影響,細(xì)胞周圍的環(huán)境也易于控制,因此結(jié)合體外試驗(yàn)?zāi)芨玫匮芯课杆岱置诘恼{(diào)節(jié)。不論是體內(nèi)還是體外試驗(yàn),都還未見CS對H+-K+-ATPase表達(dá)和活性影響的報(bào)道。因此,本試驗(yàn)通過半胱胺鹽酸鹽 (cysteaminehydrochloride,CSH,有效成分是CS)處理體外培養(yǎng)的仔豬胃黏膜細(xì)胞,探討CSH對H+-K+-ATPase表達(dá)和活性的影響,并同時(shí)觀察SS表達(dá)的變化,以期在細(xì)胞和分子水平深入揭示CS對仔豬胃酸分泌功能的調(diào)節(jié)及其可能的作用機(jī)制。　　1材料與方法　　1.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑　　28日齡哺乳期健康仔豬購自江蘇農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)豬場,體質(zhì)量8kg左右。CSH(Sigma公司,M6055,純度>98%)。DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清(杭州四季青公司),胰蛋白酶(Amresco),細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar)等。　　1.2胃黏膜細(xì)胞培養(yǎng) 　　參照Terano等方法并稍作調(diào)整。仔豬宰殺后,迅速取出胃,用4℃含5倍于正常濃度雙抗生素(青霉素100U/mL和鏈霉素100g/L)的 D-Hanks液洗去胃內(nèi)容物,分離胃底和胃竇黏膜,將黏膜剪成1mm3左右的小塊,用加正常濃度雙抗生素的0.15%胰蛋白酶37℃消化5次,每次 20min,100目網(wǎng)篩過濾,濾液以1000r/min離心10min,沉淀以Hanks液懸浮,再重復(fù)離心1次,最后沉淀以DMEM高糖培養(yǎng)液(含胎牛血清10%,青霉素100U/mL和鏈霉素100g/L)制成細(xì)胞懸液,用0.1%臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率在90%以上。將細(xì)胞調(diào)整至1×106個(gè) /mL,接種到6孔培養(yǎng)板上,然后將細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(37℃,5%CO2)。　　1.3細(xì)胞分組及處理　　1.3.1測定基因表達(dá)的細(xì)胞處理及細(xì)胞總RNA的提取　　細(xì)胞用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng),細(xì)胞分為4個(gè)組,每組4個(gè)樣本,每個(gè)樣本6孔。細(xì)胞培養(yǎng)24h后,更換培養(yǎng)液。其中對照組用基礎(chǔ)培養(yǎng)液,試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中按0.001g/L(低水平)、0.01g/L(中水平)、0.1g/L(高水平)劑量添加CSH。繼續(xù)培養(yǎng)20h。培養(yǎng)結(jié)束后,吸去培養(yǎng)液, 采用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[10]提取細(xì)胞總RNA,用紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度(260nm),并通過變性瓊脂糖電泳檢驗(yàn)總RNA的質(zhì)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。　　1.3.2測定H+-K+-ATPase活性的細(xì)胞處理　　細(xì)胞分為4組,每組6個(gè)樣本,每個(gè)樣本1孔。細(xì)胞分組、細(xì)胞培養(yǎng)液、培養(yǎng)過程及添加CSH的劑量與上一步完全相同,在培養(yǎng)結(jié)束后,吸去細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加1mL0.2%的TritonX-100破碎細(xì)胞,收集細(xì)胞破碎液,放入-20℃冰箱待測酶活性。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。　　1.4相對定量RT-PCR(semi-quantitativeRT-PCR) 　　1.4.1反轉(zhuǎn)錄(RT) 　　用隨機(jī)引物Randomhexamerprimer對所有樣品的RNA進(jìn)行RT。RT反應(yīng)總體積25μL,包括2μg總RNA,20URNA酶抑制劑,100UMMLV反轉(zhuǎn)錄酶,5μL5×RTbuffer(含250mmol/LTris-HClpH8.3,375mmol/LKCl, 15mmol/LMgCl2,50mmol/LDTT),0.4mmol/LdNTP,4μmol/L隨機(jī)引物。先加RNA模板,dNTP和隨機(jī)引物, 75℃變性5min,立即放冰上冷卻,再加其余試劑37℃反應(yīng)60min,95℃滅活5min。　　1.4.2引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增條件　　H+-K+-ATPase和SS引物根據(jù)GenBank(M22724和U36385)提供的豬H+-K+-ATPasecDNA、 SScDNA序列設(shè)計(jì)。H+-K+-ATPase的上游引物:5′-gagaaccaccacctacaag-3′,下游引物:5′- caacagcgaactccaag-3′;SS的上游引物:5′-agctgctgtctgaacccaac-3′,下游引物:5′- gaaattcttgcagccagctt-3′。引物由大連寶生物工程公司合成。采用18SrRNA作內(nèi)標(biāo),以校正加樣和擴(kuò)增效率的誤差。分別對PCR 反應(yīng)條件、循環(huán)圈數(shù)以及目的基因引物和18S引物的比例等進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)體積25μL,含2μLRT產(chǎn)物,0.5UTaqDNA聚合酶,5μL10 ×PCRBuffer(含50mmol/LTris-HClpH9.0,100mmol/LNaCl,1.0mmol/LDTT, 0.1mmol/LEDTA,50%glycerol,1.0%TritonX-100),0.2mmol/LdNTP, 1.0～2.0mmol/LMgCl2,0.7μmol/L(H+-K+-ATPase)或1.6μmol/L(SS)目的基因引物, 1.0～2.6μL18SrRNA內(nèi)標(biāo)。最后確定H+-K+-ATPase的PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,54℃退火 30s,72℃延伸30s,24個(gè)循環(huán);72℃延伸8min。SS的反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性8min;94℃變性30s,55℃退火40s,72℃延伸 40s,26個(gè)循環(huán);72℃延伸8min。產(chǎn)物置4℃冰箱待測。PCR反應(yīng)在GeneAmpPCRsystem9600型(PerkinElmer, USA)上進(jìn)行。分別用水和不經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄的RNA樣品作為對照進(jìn)行PCR反應(yīng),用于檢測反應(yīng)體系中是否有外源DNA或基因組DNA污染。　　1.4.3電泳及灰度分析　　取20μLPCR產(chǎn)物在含EB的2.0%瓊脂糖凝膠上電泳。圖像處理及灰度分析用 KodakIDElectropheresisDocumentationandanalysisSystem120(KodakPhotoFilmCo., Ltd.,USA)進(jìn)行,根據(jù)目的基因和18SPCR產(chǎn)物的灰度比,確定樣品中H+-K+-ATPase和SSmRNA表達(dá)的相對含量。　　1.5H+-K+-ATPase活性測定　　按試劑盒說明進(jìn)行測定,試劑盒購自南京建成生物工程公司。主要步驟為將細(xì)胞裂解液以1000r/min離心10min吸上清,然后添加H+-K +-ATPase激活劑,45℃溫浴10min,最后用紫外分光光度計(jì)測定樣品中磷的含量,另外用考馬斯亮藍(lán)法測定細(xì)胞中總蛋白含量,結(jié)果以反應(yīng)1h內(nèi)H +-K+-ATPase磷酸化釋放磷量和細(xì)胞中總蛋白含量比值來表示H+-K+-ATPase活性,單位為每小時(shí)每克總蛋白中釋放多少毫摩爾的磷表示 (mmol·g-1·h-1)。1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS11.0forWindows統(tǒng)計(jì)軟件中LSD檢驗(yàn)組間差異顯著性。　　2結(jié)果　　2.1CSH對培養(yǎng)的仔豬胃黏膜細(xì)胞H+-K+-ATPase表達(dá)和活性的影響　　低水平的CSH處理后H+-K+-ATPasemRNA的相對豐度(0.73±0.11)與對照組(0.75±0.06)相比沒有顯著變化 (P>0.05),中、高水平CSH處理后H+-K+-ATPasemRNA的相對豐度(1.02±0.07,1.08±0.09)都顯著高于對照組(P<0.05),。低水平的CSH處理后H+-K+-ATPase活性(1.53±0.08)與對照組(1.60±0.10)相比也沒有顯著變化(P>0.05),而中、高水平的CSH處理后H+-K+-ATPase活性(2.40±0.21,2.34±0.26)都顯著高于對照組,分別比對照組提高了57%和53%(P<0.05)。　　2.2CSH對培養(yǎng)的仔豬胃粘膜細(xì)胞中SSmRNA表達(dá)的影響　　低水平CSH處理細(xì)胞時(shí),試驗(yàn)組SSmRNA的相對豐度(0.85±0.06)與對照組(0.77±0.06)相比沒有顯著的變化(P> 0.05),但中、高水平CSH處理后SSmRNA的相對豐度(1.17±0.13,1.17±0.15)都顯著高于對照組(P<0.05). 　　3討論　　H+-K+-ATPase在mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)水平均呈明顯的發(fā)育性變化。Yang等于19日齡大鼠胎兒胃底腺中檢測到H+-K+- ATPase的活性,并發(fā)現(xiàn)該酶的活性隨日齡的增加而增加,進(jìn)一步研究表明該酶mRNA的表達(dá)和蛋白水平也隨日齡的增加而增加;對25～42周齡的人胎兒研究發(fā)現(xiàn),25周齡的胎兒胃中即可檢測到H+-K+-ATPase的表達(dá),并且隨著胎齡的增加表達(dá)也顯著增加。　　以上研究表明,新生動物H+-K+-ATPase的表達(dá)和活性都較低。在豬上還未見H+-K+-ATPase表示和活性的發(fā)育性變化的報(bào)道,我們推測仔豬胃酸分泌不足可能與H+-K+-ATPase的活性較低有關(guān),因此通過增強(qiáng)H+-K+-ATPase活性可能是促進(jìn)仔豬胃酸分泌的有效方法。胃酸分泌受到體內(nèi)多種激素的調(diào)節(jié),其中胃組織D細(xì)胞分泌的SS通過抑制胃泌素和組胺的分泌間接抑制H+-K+-ATPase的活性,對胃酸分泌起抑制作用, 但SS是否通過直接抑制H+-K+-ATPase的表達(dá)和活性來抑制胃酸分泌還沒有實(shí)驗(yàn)證實(shí)。CS通過破壞SS半胱氨酸殘基上的二硫鍵,使SS生物活性和免疫活性喪失,促進(jìn)胃泌素和組胺分泌,使胃酸分泌增加。用CS靜脈灌注或皮下注射大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿胃泌素的濃度、胃組織中組胺含量、胃酸分泌量都顯著增加。CS能明顯提高香豬胃泌素水平(P<0.01),促進(jìn)胃液分泌。但CS對H+-K+-ATPase的表達(dá)和活性有何影響還未見報(bào)道。我們的試驗(yàn)表明,在體外條件下,低水平的CSH對H+-K+-ATPase的表達(dá)和活性沒有影響,中、高水平的CSH可增強(qiáng)H+-K+-ATPase的表達(dá)和活性, 因此我們認(rèn)為一定水平的CS可通過增強(qiáng)H+-K+-ATPase的表達(dá)和活性來促進(jìn)仔豬胃黏膜細(xì)胞分泌胃酸。　　傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,CS的作用與細(xì)胞SS水平的降低有關(guān),但我們卻發(fā)現(xiàn)在中水平和高水平時(shí),CSH提高了SSmRNA的表達(dá)。我們推測可能是CS耗竭SS,而后者濃度的下降可能反饋性地促進(jìn)其合成,因此其mRNA表達(dá)升高。Kanayama等發(fā)現(xiàn)SS自身可以調(diào)節(jié)SSmRNA的表達(dá); Papachristou等也認(rèn)為CS耗竭SS后,SSmRNA的上調(diào)可能與SS的反饋性自身調(diào)節(jié)有關(guān)。　　綜上所述,我們的試驗(yàn)表明CSH可增強(qiáng)體外培養(yǎng)的仔豬胃黏膜細(xì)胞H+-K+-ATPase的表達(dá)及活性,而這一作用可能通過SS介導(dǎo),而其他胃液分泌調(diào)節(jié)因子,如胃泌素和組胺,是否也參與CSH對H+-K+-ATPase表達(dá)及活性的調(diào)節(jié),還有待進(jìn)一步研究