飼料添加劑中木聚糖酶活力的測定分光光度法

和興

飼料添加劑中木聚糖酶活力的測定分光光度法
1.1木聚糖酶活力單位
在37℃、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為10mg/ml的木聚糖溶液中降解釋放1umol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U。
1.2.原理
木聚糖酶能將木聚糖降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)液顏色的強度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中纖維素酶的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應(yīng)液顏色的強度，可以計算反應(yīng)液中纖維素酶的活力。
1.3.試劑與溶液
除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的二級水。
1.3.1氫氧化鈉溶液，濃度c(NaOH)為200g/L
稱取氫氧化鈉20.0g。加水溶解，定容至100ml。
1.3.2乙酸溶液，濃度c（CH3COOH）為0.1mol/L
吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。
1.3.3乙酸鈉溶液，濃度c（CH3COONa）為0.1mol/L
稱取三水乙酸鈉1.36g。加水溶解，定容至100ml。
1.3.4乙酸—乙酸鈉緩沖溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）為0.1mol/L，pH值為5.5：
稱取三水乙酸鈉23.14g，加入冰乙酸1.70ml。在加水溶解，定容至2000ml。測定溶液的pH值。如果pH值偏離5.5，再用乙酸溶液（1.3.2）或乙酸鈉溶液（1.3.3）調(diào)節(jié)至5.5。
1.3.5木糖溶液，濃度c（C5H10O5）為10.0mg/ml:
稱取無水木糖1.000g，加乙酸—乙酸鈉緩沖液（1.3.4）溶解，定容至100ml。
1.3.6木聚糖溶液：1.0%
稱?。⊿igma X0627）1.00g，加入80ml乙酸—乙酸鈉緩沖溶液（1.3.4）。磁力攪拌，同時緩慢加熱，直至木聚糖完全溶解（注：在攪拌加熱的過程中可以補加適量的緩沖液，但是溶液的總體積不能超過100ml。）。然后停止加熱，繼續(xù)攪拌30min，用乙酸—乙酸鈉緩沖溶液（1.3.4）定容至100ml。木聚糖溶液能立即使用，使用前適當(dāng)搖勻，4℃避光保存，有效期為3天。
1.3.7 DNS試劑
稱取3，5-二硝基水楊酸3.15g（化學(xué)純），加水500ml，攪拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100ml氫氧化鈉溶液（1.3.1），同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48℃。）。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續(xù)45℃水浴加熱，同時補加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000ml。用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個月。
1.4儀器與設(shè)備
1.4.1 實驗室用樣品粉碎機或碾缽。
1.4.2 分樣篩：孔徑為0.25mm（60目）。
1.4.3 分析天平：感量0.001g。
1.4.4 pH計：精確至0.01。
1.4.5 磁力攪拌器：附加熱功能。
1.4.6 電磁振蕩器
1.4.7 燒結(jié)玻璃過濾器：孔徑為0.45um。
1.4.8 離心機：3000 r/min
1.4.9 恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在30—60℃之間，精度為0.1℃。
1.4.10 秒表：每小時誤差不超過5s。
1.4.11 分光光度計：能檢測350—800nm的吸光度范圍。
1.4.12 移液器：精度為1 ul。
1.4.13 冰箱。
1.5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
吸取緩沖液（1.3.4）4.0ml，加入DNS試劑（1.3.7）5.0ml，沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，用水定容至25.0ml，制成標(biāo)準(zhǔn)空白樣。?
分別吸取木糖溶液（1.3.5）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、和7.00ml，分別用緩沖液（1.3.4）定容至100ml，配制成濃度為0.10-0.70mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。
分別吸取上述濃度系列的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.00ml（做兩個平行），分別加入到刻度試管中，再分別加入2ml緩沖液（1.3.4）和5ml DNS試劑（1.3.7）。電磁振蕩3s，沸水浴加熱5min。然后用自來水冷卻到室溫，再用水定容至25ml。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為對照調(diào)零，在540nm處測定吸光度OD值。
以葡萄糖濃度為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.6試樣溶液的制備
固體樣品應(yīng)粉碎或充分碾碎，然后過60目篩（孔徑為0.25mm），按照附錄A中建議的稱樣量稱取試樣兩份，精確至0.001g。加入40ml乙酸—乙酸鈉緩沖溶液（5.4）。磁力攪拌30min，再用緩沖液（5.4）定容至100ml，在4℃條件下避光保存24h。搖勻，取出30-50ml，上離心機3min。吸取5.00ml上清液，再用緩沖液（5.4）做二次稀釋（稀釋后的待測酶液中纖維素酶活力最好控制在0.04-0.08U/ml之間）。
液體樣品可以直接用乙酸—乙酸鈉緩沖溶液（5.4）進(jìn)行稀釋、定容（稀釋后的酶液中纖維素酶活力最好控制在0.04-0.08 U/ml之間）。如果稀釋后酶液的pH值偏離5.5，需要用乙酸溶液（5.2）或乙酸鈉溶液（5.3）調(diào)節(jié)校正至5.5，然后再用緩沖溶液（5.4）做適當(dāng)稀釋定容。
1.7測定步驟
吸取10.0ml羧甲基纖維素鈉溶液（5.6），37℃平衡10min。
吸取10.0ml經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液，37℃平衡10min。
吸取2.00ml經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液（已經(jīng)過37℃平衡），加入到刻度試過中，再加入5ml DNS 試劑（1.3.7），電磁振蕩3s。然后加入2.0ml羧甲基纖維素鈉溶液（1.3.6），37℃保溫30min，沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml，電磁振蕩3s。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣（參見1.5）為空白對照，在540nm處測定吸光度AB。
吸取2.00ml經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液（已經(jīng)過37℃平衡），加入到刻度試管中，再加入2.0ml羧甲基纖維素鈉（1.3.6）（已經(jīng)過37℃平衡），電磁振蕩3s，37℃精確保溫30min。加入5.0ml DNS 試劑（1.3.7），電磁振蕩3s，以終止酶解反應(yīng)。沸水浴加熱5min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml，電磁振蕩3s。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣（參見1.5）為空白對照，在540nm處測定吸光度AE。
8試樣酶活力的計算
XD=[( AE- AB)×K+ CO] ×1000×總體積/ M / T /樣品總量------（1）
X=XD·Df------------------------------------------（2）
式中：XD — 試樣稀釋液的纖維素酶活力，U/ml；
AE — 酶反應(yīng)液的吸光度；
AB — 酶空白樣的吸光度；
K — 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；
CO — 標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；
M—木糖的摩爾質(zhì)量M（C5H5O5）=150.2g/mol；
T — 酶解反應(yīng)時間，min；
1000 — 轉(zhuǎn)化因子，1mmol =1000umol；
XD值應(yīng)在0.04—0.08U/ml之間。如果不在這個范圍內(nèi)，應(yīng)重新選擇酶液的稀釋度，再進(jìn)行分析測定。
X — 試樣纖維素酶的活力，U/g；
Df — 試樣的總稀釋倍數(shù)。
酶活力的計算值保留三位有效數(shù)字。
9重復(fù)性
同一試樣兩個平行測定值的相對誤差不超過8.0%，二者的平均 值為最終的酶活力測定值（保留三位有效數(shù)字）。
　　　　　　飼料添加劑中纖維素酶活力的測定分光光度法
1.1纖維素酶活力單位
在37℃、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為4mg/ml的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1umol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U。
1.2.原理
纖維素酶能將羧甲基纖維素降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)液顏色的強度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中纖維素酶的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應(yīng)液顏色的強度，可以計算反應(yīng)液中纖維素酶的活力。
1.3.試劑與溶液
除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的二級水。
1.3.1氫氧化鈉溶液，濃度c(NaOH)為200g/L:
稱取氫氧化鈉20.0g。加水溶解，定容至100ml。
1.3.2乙酸溶液，濃度c（CH3COOH）為0.1mol/L:
吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。
1.3.3乙酸鈉溶液，濃度c（CH3COONa）為0.1mol/L:
稱取三水乙酸鈉1.36g。加水溶解，定容至100ml。
1.3.4乙酸—乙酸鈉緩沖溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）為0.1mol/L，pH值為5.5：
稱取三水乙酸鈉23.14g，加入冰乙酸1.70ml。在加水溶解，定容至2000ml。測定溶液的pH值。如果pH值偏離5.5，再用乙酸溶液（1.3.2）或乙酸鈉溶液（1.3.3）調(diào)節(jié)至5.5。
1.3.5葡萄糖溶液，濃度c（C6H12O6）為10.0mg/ml:
稱取無水葡萄糖1.000g，加乙酸—乙酸鈉緩沖液（1.3.4）溶解，定容至100ml。
1.3.6羧甲基纖維素鈉（Sigma C5678）0.80g，加入80ml乙酸—乙酸鈉緩沖溶液（1.3.4）。磁力攪拌，同時緩慢加熱，直至羧甲基纖維素鈉完全溶解（注：在攪拌加熱的過程中可以補加適量的緩沖液，但是溶液的總體積不能超過100ml。）。然后停止加熱，繼續(xù)攪拌30min，用乙酸—乙酸鈉緩沖溶液（1.3.4）定容至100ml。羧甲基纖維素鈉溶液能立即使用，使用前適當(dāng)搖勻。4℃避光保存，有效期為3天。
1.3.7 DNS試劑
稱取3，5-二硝基水楊酸3.15g（化學(xué)純），加水500ml，攪拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100ml氫氧化鈉溶液（1.3.1），同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48℃。）。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續(xù)45℃水浴加熱，同時補加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000ml。用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個月。
1.4儀器與設(shè)備
1.4.1 實驗室用樣品粉碎機或碾缽。
1.4.2 分樣篩：孔徑為0.25mm（60目）。
1.4.3 分析天平：感量0.001g。
1.4.4 pH計：精確至0.01。
1.4.5 磁力攪拌器：附加熱功能。
1.4.6 電磁振蕩器
1.4.7 燒結(jié)玻璃過濾器：孔徑為0.45um。
1.4.8 離心機：3000 r/min
1.4.9 恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在30—60℃之間，精度為0.1℃。
1.4.10 秒表：每小時誤差不超過5s。
1.4.11 分光光度計：能檢測350—800nm的吸光度范圍。
1.4.12 移液器：精度為1 ul。
1.4.13 冰箱。
1.5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
吸取緩沖液（1.3.4）4.0ml，加入DNS試劑（1.3.7）5.0ml，沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，用水定容至25.0ml，制成標(biāo)準(zhǔn)空白樣。?
分別吸取葡萄糖溶液（1.3.5）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、和7.00ml，分別用緩沖液（1.3.4）定容至100ml，配制成濃度為0.10-0.70mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。
分別吸取上述濃度系列的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.00ml（做兩個平行），分別加入到刻度試管中，再分別加入2ml緩沖液（1.3.4）和5ml DNS試劑（1.3.7）。電磁振蕩3s，沸水浴加熱5min。然后用自來水冷卻到室溫，再用水定容至25ml。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為對照調(diào)零，在540nm處測定吸光度OD值。
以葡萄糖濃度為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.6試樣溶液的制備
固體樣品應(yīng)粉碎或充分碾碎，然后過60目篩（孔徑為0.25mm），按照附錄A中建議的稱樣量稱取試樣兩份，精確至0.001g。加入40ml乙酸—乙酸鈉緩沖溶液（5.4）。磁力攪拌30min，再用緩沖液（5.4）定容至100ml，在4℃條件下避光保存24h。搖勻，取出30-50ml，上離心機3min。吸取5.00ml上清液，再用緩沖液（5.4）做二次稀釋（稀釋后的待測酶液中纖維素酶活力最好控制在0.04-0.08U/ml之間）。
液體樣品可以直接用乙酸—乙酸鈉緩沖溶液（5.4）進(jìn)行稀釋、定容（稀釋后的酶液中纖維素酶活力最好控制在0.04-0.08 U/ml之間）。如果稀釋后酶液的pH值偏離5.5，需要用乙酸溶液（5.2）或乙酸鈉溶液（5.3）調(diào)節(jié)校正至5.5，然后再用緩沖溶液（5.4）做適當(dāng)稀釋定容。
1.7測定步驟
吸取10.0ml羧甲基纖維素鈉溶液（5.6），37℃平衡10min。
吸取10.0ml經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液，37℃平衡10min。
吸取2.00ml經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液（已經(jīng)過37℃平衡），加入到刻度試過中，再加入5ml DNS 試劑（1.3.7），電磁振蕩3s。然后加入2.0ml羧甲基纖維素鈉溶液（1.3.6），37℃保溫30min，沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml，電磁振蕩3s。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣（參見1.5）為空白對照，在540nm處測定吸光度AB。
吸取2.00ml經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液（已經(jīng)過37℃平衡），加入到刻度試管中，再加入2.0ml羧甲基纖維素鈉（1.3.6）（已經(jīng)過37℃平衡），電磁振蕩3s，37℃精確保溫30min。加入5.0ml DNS 試劑（1.3.7），電磁振蕩3s，以終止酶解反應(yīng)。沸水浴加熱5min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml，電磁振蕩3s。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣（參見1.5）為空白對照，在540nm處測定吸光度AB。
8試樣酶活力的計算
XD=[( AE- AB)×K+ CO] ×1000×總體積/ M / T /樣品總量---------（1）
X=XD·Df----------------------------------------------------（2）
式中：
XD — 試樣稀釋液的纖維素酶活力，U/ml；
AE — 酶反應(yīng)液的吸光度；
AB — 酶空白樣的吸光度；
K — 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；
CO — 標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；
M — 葡萄糖的摩爾質(zhì)量M（C6H12O6）=180.2g/mol；
t — 酶解反應(yīng)時間，min；
1000 — 轉(zhuǎn)化因子，1mmol =1000umol；
XD值應(yīng)在0.04—0.08U/ml之間。如果不在這個范圍內(nèi)，應(yīng)重新選擇酶液的稀釋度，再進(jìn)行分析測定。
X — 試樣纖維素酶的活力，U/g；
Df — 試樣的總稀釋倍數(shù)。
酶活力的計算值保留三位有效數(shù)字。
9重復(fù)性
同一試樣兩個平行測定值的相對誤差不超過8.0%，二者的平均 值為最終的酶活力測定值（保留三位有效數(shù)字）。

tgz5637

按這個農(nóng)業(yè)部方法，測出的結(jié)果低。逼迫企業(yè)要改宣傳資料和批文

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-7-7 09:25 編輯 ]

feilong4120

現(xiàn)實中企業(yè)好像都有自己的企標(biāo)，完全對不上樓主這個方法！現(xiàn)在市場這么混亂，到底那個方法好好像說不清楚，再說，發(fā)酵生產(chǎn)用的菌種不一樣，酶的特性也會有所差異。用一種單一的測量模式很難判斷。

fangke3546

我們馬上也要開展這個項目，希望大家能討論下

tgz5637

夏盛的木聚糖酶酶活，報出來都嚇小朋友。1000萬單位/g 和 6000萬單位/g , 如果用農(nóng)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)檢測，你們估計是多少？我估計1000萬單位/g大約在9萬單位/g左右，6000萬單位/g大約在50萬 ,看你的XD有效取值范圍落在那個附近（靠0.04就大些，靠近0.12就更小，總之這個農(nóng)標(biāo)方法誤差很大，不靠譜）。

lichoushui

樓主：
1.7.1中應(yīng)該是木聚糖底物2ml。
這種配DNS試劑和QB 2583——2003有一些差別，這對酶活有影響嗎？