飼料中水溶性肽含量測定

和興

飼料中水溶性肽含量測定
                                                             王碧蓮 姚雄軍   華達生化科技飼料（湖北）有限公司
一、范圍
　　本標準規(guī)定了飼料中水溶性肽含量測定方法。
　　本標準適用于飼料原料、配合飼料。檢測范圍為比色溶液中亮氨酸中氮含量4-20mg/l。
二、引用標準
　　下列標準所包含的條文，通過本標準中引用而構成為本標準的條文，本標準出版時，所示版本均為有效，所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標準最新版本的可能性。
　　GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法
三、方法原理
　　先將試樣中可溶性蛋白質、游離氨基酸和氨在水中提取出來，部分提取液在110℃，6mol/l鹽酸中水解24h成單個氨基酸，經(jīng)茚三酮顯色反應在570nm處測定總氨基酸氮含量，以提取液直接與茚三酮顯色反應在570nm處測定的游離氨基酸氮含量為空白，水溶性肽含量即是總氨基酸氮含量減去游離氨基酸氮含量后再乘以轉換系數(shù)。   
本方法中樣品在酸水解過程產(chǎn)生的游離氨所帶來的誤差忽略。
四、試劑
　　本標準所用試劑，除特殊說明外，均為分析純。
　　實驗室用水應符合GB/T6682中三級水的規(guī)格。
4.1  乙酸鈉緩沖液4M  PH5.5：稱32.8g無水乙酸鈉于100ml容量瓶加60ml去離子水，緩慢加熱溶解，冷后加10ml冰乙酸，用水定容,貯存?zhèn)溆谩?br /> 4.2  鹽酸（GB622）
4.3  0.1mol/l鹽酸：8.3ml鹽酸（GB622）注入1000ml水中，貯存?zhèn)溆谩?br /> 4.4  茚三酮：稱1.67g茚三酮(HG3-984-76)于250ml容量瓶，加125ml乙二醇甲基醚（Fisher E182）,加7ml冰乙酸，25ml 4M NaAc緩沖液（4.1），用水定容，該試劑可穩(wěn)定一年，貯存棕色瓶中。
4.5 硫酸肼：稱0.26g硫酸肼（GB698-77）到1升容量瓶，溶于去離子水，加 3-4 滴濃
H2SO4, 用去離子水定容，貯存棕瓶可穩(wěn)定1年。
4.6三氯乙酸：25g三氯乙酸(HG3-1105-77)于100ml容量瓶中，加水定容。
4.7 氨基酸標準貯備液：（1000mg氨基酸氮/L）
將L-亮氨酸（L-leucine）含氮10.67%在真空干燥皿中50℃ 干燥過夜。稱0.937g干燥L-亮氨酸于100ml容量瓶，并用0.1mol/l鹽酸（4.3）溶解，并用0.1mol/l鹽酸（4.3）定容，此溶液4℃ 下可穩(wěn)定一個月。
4.8氨基酸標準工作液：
移2、4、6、8、10ml標準貯備液（4.7）于100ml溶量瓶中，用0.1mol/l鹽酸（4.3）定容成20、40、60、80和100mg氨基氮/L,此溶液4℃下可穩(wěn)定一個月。
五、儀器、設備
5.1 實驗室用樣品粉碎機
5.2 分析天平
5.3 磁力攪拌器
5.4 渦流混合儀
5.5 離心機
5.6 反應瓶：類似安瓿瓶，能密封
5.7 電熱恒溫箱：110℃±1℃
5.8 注射過濾器：帶0.45μm濾紙
5.9 真空干燥器
5.10 電熱恒溫水?。?0℃±1℃
5.11 分光光度計：備1cm比色杯，570nm
六、試樣的制備
　　選取有代表性的飼料樣品，至少500克，用四分法縮減至100克，磨碎，并過0.25mm孔徑（60目），充分混均后裝入磨口瓶中備用。
七、分析步驟
7.1  提取
　　稱取約2g樣品，精確至0.001g于磁力攪拌器（5.3）中加入20ml水，強力快速攪拌
2min，用快速濾紙過濾，收集濾過物（置于4℃冰箱中）。
7.2  提純
　　取上述提取液（7.1）8ml于離心管中，加2ml  25%三氯乙酸（4.6），并用渦流混合儀（5.4）混勻，室溫下放置反應1h后，用離心機（5.5）離心2500r×25min，移取上清液于另一試管中備用（或置于4℃冰箱中）。
7.3 水解
　　取2ml提取待測液（7.2）于5ml反應瓶中（5.6），加2ml濃鹽酸（4.2）混勻、抽真空、沖氮氣并密封，于電熱恒溫箱（5.7）110℃水解24h后，取出冷卻至室溫；用注射過濾器（5.8）過濾，取濾液1ml于另一個5ml小燒杯中并置于真空干燥器（5.9），抽真空，直到樣品完全干燥，再加4ml水溶解燒杯中殘渣，待測。
7.4  標準曲線測定
　　取各個氨基酸標準工作液（4.8）0.2ml， 0.1mol/l鹽酸（4.3）0.2ml于20ml比色管中，各加2ml茚三酮溶液（4.5）和10ml硫酸肼溶液（4.4），混勻，置于90℃水浴（5.10）15min，取出快速冷卻至室溫，以鹽酸空白比色為參照用1cm比色杯于分光光度計（5.11）570nm處測試吸光度，以氨基酸氮含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。
7.5  試樣的測定
　　準確移取提純液（7.2）0.2ml于20ml比色管中，按7.4的方法步驟測定吸光度，從標準曲線（7.4）查得試樣提純液的氨基酸氮含量(a)。
7.6  水解樣的測定
　　準確移取水解后水溶解樣品液（7.3）0.2ml于20ml比色管中，按7.4的方法步驟測定吸光度，從標準曲線（7.4）查得試樣水解液的氨基酸氮含量(b)。
八、測定結果的計算
樣品中水溶性肽含量（mg/g）按下式計算：
水溶性肽含量（mg/g）=（b/m ×mb—a/m×ma ）×3.07
式中：
a   ——由標準曲線查得試樣液氨基酸氮含量（mg）
b   ——由標準曲線查得水解液氨基酸氮含量（mg）
ma  ——試樣稀釋倍數(shù)(2.5×1.25×50)
mb  ——水解樣稀釋倍數(shù)(2.5×1.25×5×2×4×20)
m   ——樣品的質量
3.07——氮和肽的轉換系數(shù)
九、允許誤差
同一分析者對同一試樣兩次測定所得結果相對偏差≤10%。

勁松

這是華達公司的企業(yè)標準嗎？

houweqi

回復 1# 和興

請教樓主：1、此方法是否只能測定水溶性肽，非水溶性的就不能測了，還是所有的蛋白質變成肽后都會變成水溶性的。2、氨基酸標準液是只需要L-亮氨酸一種，還是需要多種氨基酸的混合標液。3、測定飼料中水溶性活性肽在養(yǎng)殖中有何意義。期待回復！