木聚糖酶酶活檢測

JH_C

底物1%燕麥木聚糖經冰凍保存取出后，會產生沉淀，能否繼續(xù)使用？

tgz5637

堿溶解法制備，2天內使用無礙。熱溶解法一天以上，最好重配。

測木聚糖，燕麥木聚糖用熱溶解法制底物，不是很好選擇。底物本身的葡萄糖含量高不說，水溶性也不如樺木木聚糖。

   現在一直宣傳在飼料用木聚糖酶測定應該采用燕麥木聚糖，我認為是誤區(qū)，因為這么說的人，忘了不論你換什么底物來測某一品牌的木聚糖酶，該品牌木聚糖酶都是同一種工程菌發(fā)酵生產的。它的催化能力，自做成成品后就已經固定下來了。行業(yè)標準是控制不了這一點的。因此對該木酶的酶活檢測只存在準確與否的問題，而不是什么底物的問題。樺木也好，燕麥也好，只是一個折算的問題。

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-7-16 12:44 編輯 ]

JH_C

謝謝指點！
有點廠家采用堿溶加熱溶的方法。其實關于底物的選擇和使用，只是現在行業(yè)內沒有一個統(tǒng)一的標準，才會出現五花八門的局面。如此說來，使用樺木木聚糖的結果應比燕麥木聚糖的低，一般會低多少呢？在其它檢測條件一致的情況下。

tgz5637

樺木木聚糖底物，測過兩個牌子 x502, fluck 95588, 結果相近，可以認為幾乎等同，可能都屬于sigma公司旗下不同品牌，但原料來源一樣。按Lot號碼查看XYLOSE含量很接近，誤差更多來自標準曲線差異。
      燕麥木聚糖x0627不同年份的葡萄糖含量似乎差異大，不知是個別還是普遍，（但想想這些原料象葡萄一樣，應該是不同年份不同含量，只是沒有紅酒那樣的價格差異罷了。） 如用x0627 ，最好用堿溶法制備底物，熱熔法不容易溶解，要長時間攪拌（確切的說是，不應在酸性條件下溶解，溶完再調pH,可避免減少還原糖發(fā)生酸水解。但方法沒有強調，我自己按糖類性質分析的。），加熱過度可能發(fā)生水解，底物空白顯色很深，導致結果很低。
     測定結果，不同的木聚糖酶，不同的機器測定結果，差異大 enzymex0627:enzyme0502=2~1.7

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-7-16 15:28 編輯 ]

JH_C

非常感謝tgz的幫助！:tiaotiao:
      我使用的是S－0627的木聚糖，用堿溶法，配制當天為均勻的混懸體，放置-16度保存第二天取出，就有沉淀析出，50度水浴30分鐘也不能重新溶解，按分析，是溶解性問題還是已經發(fā)生水解。

tgz5637

燕麥x0627,x0376溶解性就是這樣的，放置久了，里面的不溶物懸浮顆粒自然沉降（我倒是希望，有人測測這些不溶物是否就是水不溶性木聚糖），但由于底物濃度一般是飽和濃度，用前攪拌，及每次加入試管前都振蕩一下。測定結果與剛配的差異不大，不攪拌吸取的是上清液，可能造成試管中底物濃度偏低。

底物放置久，3天以上，測定結果偏大（之前說的時間，也是指冷藏非冷凍）。  冷凍時間可以好長，試過一個月都可用，要加個已知酶活做參照。

yzlingyz

曾和其它負責技術的同事一同討論過關于用DNS方法來測木聚糖酶活性，大致認同用DNS方法測木聚糖酶活性得出的結論和實際運用效果不具有相關性，其只能表明如果結果酶活高，其外切酶的活性高；真正具有相關性的方法應該是測粘度的方法，其得出的結果與實際應用效果一致度較高，但其需要粘度計及豐富的經驗才可，且所需時間較長。希望國家相關的機構能盡快制定相關的標準。以上觀點只是探討，僅提供參考。

tgz5637

那就得有人再出8萬元，來再搞個標準了。
粘度法不是一般飼料企業(yè)能夠做的，而用染色法測的問題與濾紙法測纖維素酶的問題一樣，是在底物不飽和條件下檢測，可定性半定量比較，是較可取的方法。

wangyong000216

其實無論木聚糖底物是通過堿溶解也好，還是沸水煮沸溶解也罷，都有各自的局限性。前者通過添加氫氧化鈉使木聚糖溶解如緩沖液中，其中在溶解的過程中木聚糖分子結構就已經被強堿破壞了，才使得木聚糖底物全部溶于溶液中（正常的木聚糖，他的溶解性較差），因此所測出的酶活并不能真正反映出對實際飼料中木聚糖的水解活性。而后者通過沸水煮沸，然后離心取木聚糖上清液作為底物溶液，這樣測定出來的酶活則只能反應出對可溶性木聚糖的水解活性。