木聚糖酶酶活檢測(cè)

JH_C

底物1%燕麥木聚糖經(jīng)冰凍保存取出后，會(huì)產(chǎn)生沉淀，能否繼續(xù)使用？

tgz5637

堿溶解法制備，2天內(nèi)使用無(wú)礙。熱溶解法一天以上，最好重配。

測(cè)木聚糖，燕麥木聚糖用熱溶解法制底物，不是很好選擇。底物本身的葡萄糖含量高不說(shuō)，水溶性也不如樺木木聚糖。

   現(xiàn)在一直宣傳在飼料用木聚糖酶測(cè)定應(yīng)該采用燕麥木聚糖，我認(rèn)為是誤區(qū)，因?yàn)檫@么說(shuō)的人，忘了不論你換什么底物來(lái)測(cè)某一品牌的木聚糖酶，該品牌木聚糖酶都是同一種工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的。它的催化能力，自做成成品后就已經(jīng)固定下來(lái)了。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是控制不了這一點(diǎn)的。因此對(duì)該木酶的酶活檢測(cè)只存在準(zhǔn)確與否的問(wèn)題，而不是什么底物的問(wèn)題。樺木也好，燕麥也好，只是一個(gè)折算的問(wèn)題。

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-7-16 12:44 編輯 ]

JH_C

謝謝指點(diǎn)！
有點(diǎn)廠家采用堿溶加熱溶的方法。其實(shí)關(guān)于底物的選擇和使用，只是現(xiàn)在行業(yè)內(nèi)沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，才會(huì)出現(xiàn)五花八門(mén)的局面。如此說(shuō)來(lái)，使用樺木木聚糖的結(jié)果應(yīng)比燕麥木聚糖的低，一般會(huì)低多少呢？在其它檢測(cè)條件一致的情況下。

tgz5637

樺木木聚糖底物，測(cè)過(guò)兩個(gè)牌子 x502, fluck 95588, 結(jié)果相近，可以認(rèn)為幾乎等同，可能都屬于sigma公司旗下不同品牌，但原料來(lái)源一樣。按Lot號(hào)碼查看XYLOSE含量很接近，誤差更多來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)曲線差異。
      燕麥木聚糖x0627不同年份的葡萄糖含量似乎差異大，不知是個(gè)別還是普遍，（但想想這些原料象葡萄一樣，應(yīng)該是不同年份不同含量，只是沒(méi)有紅酒那樣的價(jià)格差異罷了。） 如用x0627 ，最好用堿溶法制備底物，熱熔法不容易溶解，要長(zhǎng)時(shí)間攪拌（確切的說(shuō)是，不應(yīng)在酸性條件下溶解，溶完再調(diào)pH,可避免減少還原糖發(fā)生酸水解。但方法沒(méi)有強(qiáng)調(diào)，我自己按糖類(lèi)性質(zhì)分析的。），加熱過(guò)度可能發(fā)生水解，底物空白顯色很深，導(dǎo)致結(jié)果很低。
     測(cè)定結(jié)果，不同的木聚糖酶，不同的機(jī)器測(cè)定結(jié)果，差異大 enzymex0627:enzyme0502=2~1.7

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-7-16 15:28 編輯 ]

JH_C

非常感謝tgz的幫助！:tiaotiao:
      我使用的是S－0627的木聚糖，用堿溶法，配制當(dāng)天為均勻的混懸體，放置-16度保存第二天取出，就有沉淀析出，50度水浴30分鐘也不能重新溶解，按分析，是溶解性問(wèn)題還是已經(jīng)發(fā)生水解。

tgz5637

燕麥x0627,x0376溶解性就是這樣的，放置久了，里面的不溶物懸浮顆粒自然沉降（我倒是希望，有人測(cè)測(cè)這些不溶物是否就是水不溶性木聚糖），但由于底物濃度一般是飽和濃度，用前攪拌，及每次加入試管前都振蕩一下。測(cè)定結(jié)果與剛配的差異不大，不攪拌吸取的是上清液，可能造成試管中底物濃度偏低。

底物放置久，3天以上，測(cè)定結(jié)果偏大（之前說(shuō)的時(shí)間，也是指冷藏非冷凍）。  冷凍時(shí)間可以好長(zhǎng)，試過(guò)一個(gè)月都可用，要加個(gè)已知酶活做參照。

yzlingyz

曾和其它負(fù)責(zé)技術(shù)的同事一同討論過(guò)關(guān)于用DNS方法來(lái)測(cè)木聚糖酶活性，大致認(rèn)同用DNS方法測(cè)木聚糖酶活性得出的結(jié)論和實(shí)際運(yùn)用效果不具有相關(guān)性，其只能表明如果結(jié)果酶活高，其外切酶的活性高；真正具有相關(guān)性的方法應(yīng)該是測(cè)粘度的方法，其得出的結(jié)果與實(shí)際應(yīng)用效果一致度較高，但其需要粘度計(jì)及豐富的經(jīng)驗(yàn)才可，且所需時(shí)間較長(zhǎng)。希望國(guó)家相關(guān)的機(jī)構(gòu)能盡快制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。以上觀點(diǎn)只是探討，僅提供參考。

tgz5637

那就得有人再出8萬(wàn)元，來(lái)再搞個(gè)標(biāo)準(zhǔn)了。
粘度法不是一般飼料企業(yè)能夠做的，而用染色法測(cè)的問(wèn)題與濾紙法測(cè)纖維素酶的問(wèn)題一樣，是在底物不飽和條件下檢測(cè)，可定性半定量比較，是較可取的方法。

wangyong000216

其實(shí)無(wú)論木聚糖底物是通過(guò)堿溶解也好，還是沸水煮沸溶解也罷，都有各自的局限性。前者通過(guò)添加氫氧化鈉使木聚糖溶解如緩沖液中，其中在溶解的過(guò)程中木聚糖分子結(jié)構(gòu)就已經(jīng)被強(qiáng)堿破壞了，才使得木聚糖底物全部溶于溶液中（正常的木聚糖，他的溶解性較差），因此所測(cè)出的酶活并不能真正反映出對(duì)實(shí)際飼料中木聚糖的水解活性。而后者通過(guò)沸水煮沸，然后離心取木聚糖上清液作為底物溶液，這樣測(cè)定出來(lái)的酶活則只能反應(yīng)出對(duì)可溶性木聚糖的水解活性。