纖維素酶活力的測定方法

和興

1．纖維素酶的活力單位定義：
在50℃，pH為4.8條件下，每分鐘從濃度為10mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個活力單位（IU）。
2．測定原理
在50℃，pH為4.8條件下纖維素酶水解纖維素，產(chǎn)生分子量較小的聚合物和還原糖，還原糖可將3，5-二硝基水楊酸中的硝基還原成橙色的氨基化合物。利用比色法測出還原糖的量，從而計算出酶活力。
3．試劑和溶液
3．110.0mg/mL 的葡萄糖溶液
稱取的無水葡萄糖1.0000g加水溶解后定容至100mL。
3．20.05 mol/L的檸檬酸鹽酸性緩沖液
a、0.5mol/L檸檬酸溶液
準確稱取105.0g檸檬酸完全溶解于800mL的蒸餾水中，定容至1000mL，標記為A溶液；
b、0.5mol/L檸檬酸三鈉溶液
準確稱取147.0g檸檬酸三鈉完全溶解于800mL的蒸餾水中，定容至1000mL，標記為B溶液；
c、0.5mol/L的檸檬酸鈉緩沖液
取600mL的A液與1000mL的B液充分混勻，標記為C液。
d、0.05mol/L的檸檬酸鹽酸性緩沖液（pH=4.80）
取C液1000mL加入到8000mL 的蒸餾水中，必要時用3mol/L的鹽酸溶液或3mol/L的氫氧化鈉溶液調pH為4.80，再定容10000mL，混勻后標記為0.05mol/L的酸性緩沖液，同時標記pH=4.80、配制日期。在4℃冰箱內保存。
3．31.0％CMC底物
精密稱取羧甲基纖維素鈉1.0000g溶于80mL0.1mol/L的酸性緩沖液中，室溫下磁力攪拌至完全溶解(3小時以上)。用3mol/L鹽酸溶液或3mol/L的氫氧化鈉溶液調pH值為4.80，再用0.05mol/L的酸性緩沖液定容在100mL的容量瓶中。標記為1.0%酸性羧甲基纖維素鈉溶液，同時標記pH=4.80、配制日期。保存在4℃的冰箱內。使用前恢復到室溫并搖均。
3．4DNS試劑
溶解10.0g 3，5-二硝基水楊酸、16g氫氧化鈉和300g酒石酸鉀鈉于約700mL蒸餾水中，加熱攪拌使完全溶解至澄清，放至常溫并定容至1000mL，置棕色試劑瓶中，暗處保存一個星期后使用。
4．儀器和設備
4．1 分析天平：感量0.0001g
4．2 精密pH計：精確至0.01
4．3 磁力加熱攪拌器
4．4 分光光度計：應符合GB9721有關規(guī)定，5mm比色皿
4．5 電熱恒溫水浴鍋：30-100℃，±0.1℃
4．6 計時器：每小時誤差不超過五秒
4．7 移液器：100-1000μl
4．8 微樣進量器：0-50μl
5．標準曲線的繪制
取8支試管按下表加入試劑，稀釋葡萄糖標準液；再加入3mL DNS試劑。充分混勻置沸水中煮10min，水浴冷卻后，用0號試管做對照在540nm下測其它試液的吸光度。以吸光度為縱坐標，以葡萄糖含量為橫坐標繪制標準曲線。

試管號	0	1	2	3	4	5	6	7
緩沖液加入量（μL）	500	490	480	475	470	465	460	455
葡萄糖標準液（μL）	0	10	20	25	30	35	40	45
葡萄糖含量（μg）	0	100	200	250	300	350	400	450

6．待測酶液的制備
精密稱取固體原酶粉1.0000g溶于80mL蒸餾水中（稀釋倍數(shù)≤100倍直接用緩沖液溶解）；室溫下磁力攪拌15min以上，用100mL容量瓶定容，離心后取上清液用緩沖液稀釋，使其吸光度在0.2-0.25之間。
7．水平控制液的制備
吸取1.0mL纖維素酶標準液，（標示酶活力為2500IU/Ml），用0.05mol/L的檸檬酸鹽酸性（pH=4.80）的緩沖液稀釋10000倍。新鮮水平控制液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
8．測定步驟
8．1 取三支試管各加入0.5mL底物，與待測酶液一起在50℃（±1℃）水浴中預熱5min。
8．2在第一、二試管中各加入0.5mL的待測酶液，50℃水浴中反應10min。
8．3 在三支試管中各加入3mL 的DNS試劑，然后在第三支試管中加入0.5mL的待測酶液。
8．4搖勻三支試管后，在沸水浴中煮10min。
8．5水浴冷卻至室溫后，以第三支試管為對照在540nm條件下測第一、二支試管的吸光值。吸光值以0.2-0.25之間為宜，若不在此范圍內可改變稀釋倍數(shù)重做。
9．結果計算
酶活力（IU/g或IU/mL）=（葡萄糖等量值/180/10/0.5）×n
式中：180指葡萄糖從微克換算成微克分子數(shù)
10指待測液與低物的反應時間
0.5指低物反應的待測酶液量
n指原酶液的稀釋倍數(shù)
10．允許分析結果可以接受標準：
10．1允許總分析誤差范圍，兩次取樣并且檢測結果相對誤差小于10%。
10．2水平控制檢測酶活力與標準酶活力誤差小于10%
10．3標準曲線至少由5點組成

fjcwr

這是國家標準的檢測方法嗎?

lichoushui

問一下樓主DNS試劑為什么不加苯酚和亞硫酸鈉？這對酶活有沒影響？會不會影響顯色顏色？和國標相差較大

游人學子

？？？自主研發(fā)的方法嗎？還是廠家提供的？

lichoushui

不是啊
是QB2583-2003