中和抗體在抗豬繁殖與呼吸綜合征感染過程中的作用

和興

摘 要：中和抗體在抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染過程中起重要作用,被動輸入PRRSV的中和抗體可預(yù)防PRRSV感染妊娠母豬，并且對母豬和仔豬都可起到消除性免疫作用。然而在自然感染PRRSV的過程中，這種中和抗體產(chǎn)生較晚,為病毒在宿主體內(nèi)大量復(fù)制并感染其他易感動物提供了充裕的時(shí)間。PRRSV的主要中和位點(diǎn)位于糖蛋白GP5,核心區(qū)域稱作B位點(diǎn), GP5的另一個(gè)顯性表位稱作A位點(diǎn),是非中和位點(diǎn)。A位點(diǎn)與B位點(diǎn)的同時(shí)出現(xiàn)將會抑制機(jī)體對B位點(diǎn)的免疫反應(yīng)。當(dāng)PRRSV發(fā)生中和位點(diǎn)突變時(shí)，產(chǎn)生無位點(diǎn)A的PRRSV，這種類型的PRRSV可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。文章通過對PRRSV的免疫反應(yīng)、中和抗體的作用以及中和位點(diǎn)等三方面的闡述,綜述了中和抗體在抗PRRSV感染過程中的作用。

關(guān)鍵詞：中和抗體；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；疫苗

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病［1］。該病于1987年在美國首次報(bào)道，1990年在德國也曾有報(bào)道，1990年-1991年冬季荷蘭和比利時(shí)發(fā)生本病，并擴(kuò)散到英國，1992年侵入到法國。加拿大和希臘也有發(fā)病的報(bào)告,英國和美國稱它為豬“藍(lán)耳病”。通過空氣和豬的轉(zhuǎn)移是本病的主要流行方式，健康豬與病豬接觸、排泄物與分泌物污染的飼料等是本病傳播的主要途徑。臨床表現(xiàn)為母豬繁殖障礙，呈現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及弱仔等癥狀，仔豬及育成豬表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀。根據(jù)臨床癥狀，基因和抗原性的不同，PRRSV可分為北美型和歐洲型分離株［2］。由于PRRSV具有抗原變異的特性，并且它的主要靶細(xì)胞是具有重要免疫作用的豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophage, PAM)，因此，PRRSV的感染常引發(fā)其他病原的繼發(fā)感染，尤其是呼吸道病原的感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，亞洲的日本、韓國、菲律賓等國也有該病的報(bào)道。1996年哈爾濱獸醫(yī)研究所在國內(nèi)首次分離到PRRSV，證實(shí)本病在國內(nèi)存在［3］。PRRSV屬動脈炎病毒科(Arteriviridae)，該科還包括鼠乳酸脫氫酶增高癥病毒(Lactate dehydrogenasee levating virus，LDV)、馬動脈炎病毒(Equine arteritis virus，EAV)、猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fever virus，SHFV)［4］。1992年OIE將PRRS列為Ｂ類動物疾病。該病毒粒子呈球形，直徑約為48 nm～83 nm，核衣殼直徑約為25 nm～30 nm，外繞脂質(zhì)雙層膜，含一個(gè)球形立體對稱的、具有電子致密性的二十面體核衣殼；表面有明顯突起；用氯仿或乙醚等脂溶劑處理可滅活病毒，證明該病毒粒子存在囊膜。在氯化銫中浮密度為1.19，在蔗糖中為1.14；該病毒不能凝集哺乳動物，如豬、羊、牛、鼠、馬、兔、鴨、雞和人O型紅細(xì)胞；對熱不穩(wěn)定，在4 ℃以上逐漸失去感染性，56 ℃經(jīng)15 min～20 min失活［2］。

PRRSV一個(gè)顯著的生物學(xué)特性是對PAM的親嗜性，PAM是首選增殖系統(tǒng)。雖然呼吸道的上皮細(xì)胞也可被感染，但在肺臟病毒滴度可達(dá)105 TCID50/ｇ肺組織。盡管在脫落的肺泡樣細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞也檢測到PRRSV，但PAM占肺臟受感染細(xì)胞的80%～94%[4]。PRRSV的另一個(gè)重要生物學(xué)特性是抗體依賴性增強(qiáng)作用(antibody dependent enhancement，ADE)。所謂ADE是指在一定抗體的存在下可介導(dǎo)和加強(qiáng)感染［4］。在豬肺泡PAM培養(yǎng)物中加入一定滴度的PRRSV抗體，可使PRRSV產(chǎn)量提高10倍～100倍。用加有PRRSV抗體的病毒培養(yǎng)物接種妊娠中期母豬，可提高病毒在胎兒中的復(fù)制，且顯著高于單純接種病毒組。反映在臨床上則是剛斷乳的仔豬呼吸道疾病臨床癥狀經(jīng)常比較大的育成豬嚴(yán)重得多[5]。

1 感染免疫反應(yīng)

有報(bào)道稱，豬人工感染后早期一段時(shí)間內(nèi)，許多病例出現(xiàn)臨床癥狀和病毒在肺臟及其他組織的巨噬細(xì)胞中大量增殖的特征，然后出現(xiàn)組織高病毒含量和無細(xì)胞病毒血癥，可持續(xù)一個(gè)月以上[6]。在感染晚期，PRRSV在特定位點(diǎn)持續(xù)低水平存在，主要存在于淋巴組織。病毒持續(xù)感染包括不間斷的低水平的病毒復(fù)制，這個(gè)過程估計(jì)最少持續(xù)150 d[7-8]。大多數(shù)青年豬感染實(shí)驗(yàn)表明，在病毒感染豬后2個(gè)月左右，是與其他動物接觸傳染最有效時(shí)期。盡管持續(xù)感染的真正機(jī)制還不清楚，但PRRSV之所以在恢復(fù)期動物體內(nèi)持續(xù)存在，是因?yàn)樗拗髅庖唧w系不能建立有效的免疫保護(hù)作為主要致病因子的說法是合理的。因此，很多人認(rèn)為免疫系統(tǒng)對豬抗PRRSV感染是無效的。豬感染PRRSV后約4周發(fā)生T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，這種反應(yīng)從感染后第9天到第14周[9]都可被檢測到。在接毒后早期能檢測到強(qiáng)抗體反應(yīng)，開始于感染后7 d～9 d，這種血清反應(yīng)可通過間接熒光抗體反應(yīng)檢測到[10]。然而，沒有證據(jù)表明這種早期產(chǎn)生的抗體能夠保護(hù)豬不受PRRSV感染，這種早期產(chǎn)生的抗體在體外不能中和PRRSV[11]。具有中和活性的PRRSV抗體只出現(xiàn)在感染后期[12]早期明顯的PRRSV和抗PRRSV特異性抗體同時(shí)存在于循環(huán)體系中，說明早期產(chǎn)生的抗體沒有能力保護(hù)機(jī)體不受PRRSV感染。感染早期血清中存在的PRRSV抗體能刺激PRRSV在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，不論是在體內(nèi)還是在體外[12],因而早期產(chǎn)生的抗體似乎無保護(hù)作用，相反可能是有害的。豬感染PRRSV也會發(fā)生針對病毒的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，說明CD4輔助性細(xì)胞也被活化。衡量T細(xì)胞毒性的IFN-γ也由T細(xì)胞產(chǎn)生[9]， CD4+ T細(xì)胞的目標(biāo)是膜蛋白(M蛋白)和GP5(glycoprotein Ⅴ，GP5)，然而CD4+ T細(xì)胞的保護(hù)性反應(yīng)和中和抗體的產(chǎn)生一樣，發(fā)生較晚。

2 中和抗體的作用

由于在用PRRSV攻毒后中和抗體的產(chǎn)生較慢而且不規(guī)則，所以中和抗體在保護(hù)機(jī)體免受PRRSV感染中所起的作用是有限的[13-14]。然而有報(bào)告指出中和抗體可以防止病毒血癥的發(fā)生；近年有人報(bào)道，病毒血癥的清除與抗GP5的抗體的出現(xiàn)密切相關(guān)[13-14]；另外，免疫接種GP5和M蛋白可提供一定程度的保護(hù)，這種保護(hù)與中和抗體的出現(xiàn)密切相關(guān)[15]。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的評估中和抗體保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)方法是在易感動物攻毒后人工被動輸入單克隆或多克隆抗體。一些病例中和抗體的出現(xiàn)削弱了機(jī)體抗特定病毒的免疫反應(yīng)，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒和人免疫缺陷病毒[16]；在另一些病例中，被動免疫可提供堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)作用。中和抗體的重要性已在其他動脈炎病毒感染中得到證實(shí)，例如馬動脈炎病毒感染，中和抗體調(diào)理起主要作用，可作為動脈炎病毒的樣本；另外，中和抗體在血清中的出現(xiàn)和病毒清除是同步的[17]；被動輸入中和抗體可降低EAV的復(fù)制并預(yù)防其感染。中和抗體主要是抗糖蛋白GL（GL是EAV的GP5中約含100個(gè)氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域，EAV的主要中和表位在GL蛋白，定位在親水性胞外結(jié)構(gòu)域N端1/2部分，約有99個(gè)～106個(gè)氨基酸）[15]。免疫接種重組基因疫苗(大腸桿菌中表達(dá)的GL蛋白的18位～122位氨基酸),發(fā)現(xiàn)中和抗體水平與對動物的保護(hù)力呈正相關(guān)，確證了中和抗體在保護(hù)動物抗EAV感染的重要性[18-19]。LDV是另一個(gè)被深入研究的動脈炎病毒，這個(gè)病毒可引起鼠的無癥狀感染，抗LDV中和抗體輸入小鼠體內(nèi)可防止其感染LDV[20]。

許多報(bào)告指出中和抗體在抗PRRSV感染中起重要作用。有報(bào)告指出PRRSV自體滅活疫苗不能產(chǎn)生中和抗體，因而保護(hù)作用較弱；而弱毒疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，因而有一定的保護(hù)作用[15]。盡管動物在感染PRRSV后或許細(xì)胞免疫和中和抗體在清除病毒過程中都起作用，但迄今為止證據(jù)只表明后者的重要性。另外，用PRRSV GP5接種免疫豬后可誘導(dǎo)產(chǎn)生中等水平的中和抗體，盡管如此，當(dāng)用同種（或同源）毒株攻毒時(shí)，豬可被保護(hù)，僅表現(xiàn)輕微發(fā)熱，用MARC-145細(xì)胞只能從肺和縱膈淋巴結(jié)回收到病毒，攻毒2周后，中和抗體滴度增加到128[18-19]。因此，免疫接種PRRSV GP5的DNA疫苗和PRRSV弱毒疫苗都能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，都有一定保護(hù)作用。最近有人進(jìn)行了血清輸入實(shí)驗(yàn)，提供了確鑿的證據(jù)證實(shí)單獨(dú)使用中和抗體可以完全防止PRRSV感染妊娠母豬；另外，無論是仔豬還是母豬，被動輸入的中和抗體可起消除性免疫的作用，可使感染豬用病毒分離法和RT-PCR法不能從淋巴器官檢測到病毒；同樣，中和抗體對幼豬也有保護(hù)作用，能夠100%保護(hù)易感動物抗PRRSV病毒血癥的最低抗體滴度是1∶8[10]。因此，無論是母豬還是仔豬，中和抗體在血清中的滴度與對豬抗PRRSV感染的免疫保護(hù)作用呈正相關(guān)。這些資料說明，通過被動輸入中和抗體的方法可為處于易感染PRRSV的動物提供及時(shí)保護(hù)。已有人用通過DNA重組技術(shù)克隆中和抗體基因獲得的高濃度的中和抗體被動輸入動物體，可作為治療方法[20]；也有人用PRSSV免疫接種母雞，然后從純化雞胚中的高滴度的中和抗體被動輸入動物體，使動物體處于中和抗體保護(hù)狀態(tài)，同時(shí)也可清除動物體內(nèi)的病毒[21]。

3 中和位點(diǎn)

眾所周知，PRRSV的主要中和位點(diǎn)位于GP5蛋白[22-23]，另一個(gè)中和位點(diǎn)在M蛋白。GP5蛋白胞外結(jié)構(gòu)域氨基端高度糖基化，并與M蛋白形成異原二聚體[22-23]，用反向免疫法和其他涉及重疊蛋白的研究確證GP5主要中和位點(diǎn)與中和抗體的活動相關(guān)，這個(gè)位點(diǎn)的最小抗原區(qū)域在33位～47位氨基酸，已被確認(rèn)是中和表位的核心區(qū)域[24]。這個(gè)核心區(qū)域被稱做B位點(diǎn)，B位點(diǎn)可被單克隆抗體所識別，并且可誘導(dǎo)產(chǎn)生我們已用于上述被動免疫試驗(yàn)的抗體[25]。另外，Wissink E證實(shí)中和單克隆抗體可識別歐洲株的胞外域N端,Plagma P用恢復(fù)期動物血清發(fā)現(xiàn)，中和位點(diǎn)在歐洲株和美洲株都存在。兩種病毒中和位點(diǎn)定位與上述B位點(diǎn)定位相同，所有結(jié)果證實(shí)GP5胞外域?qū)RRSV起重要的生物學(xué)作用。

GP5的另一個(gè)顯性表位被稱作A位點(diǎn)。在PRRSV感染后表位A迅速誘導(dǎo)非中和抗體產(chǎn)生。A位點(diǎn)的核心部分在GP5蛋白的第7位氨基酸，在B位點(diǎn)上游，GP5的氨基端[24]。它的特征與Decoy表位功能相似。Decoy位點(diǎn)是那些導(dǎo)致與中和位點(diǎn)免疫反應(yīng)性降低的毗鄰于中和位點(diǎn)的位點(diǎn)，例如,在人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的GP41蛋白[25]。HIV的糖蛋白41(GP41)蛋白的中和位點(diǎn)（ERDRD 位點(diǎn)）對兔有免疫原性，然而當(dāng)位點(diǎn)ERDRD多肽與非中和位點(diǎn)(IEEE位點(diǎn))并列存在時(shí)， ERDRD位點(diǎn)對兔的免疫原性消失了。無中和活性的IEEE位點(diǎn)與位點(diǎn)ERDRD相距約兩個(gè)氨基酸，因此，可推測是非中和位點(diǎn)降低了中和位點(diǎn)的免疫原性。用含位點(diǎn)ERERD而無IEEE位點(diǎn)多肽免疫接種小鼠，可使獲得的血清中抗ERDRD位點(diǎn)的抗體濃度在0.1 μg/mL~0.2 μg/mL[26]。

已被深入研究的LDV的中和位點(diǎn)位于VP-3P(LDV的主要糖蛋白)的37位~44位氨基酸之間，這是LDV惟一的中和位點(diǎn)，代表VP-3P的合成多肽可被中和單克隆抗體識別，這個(gè)合成多肽可用于ELISA檢測血清中的中和抗體[16]。然而，針對這段多肽的抗體不能中和LDV，說明這段多肽不是最優(yōu)化構(gòu)象[22]。與PRRSV的GP5表位相似的多肽通過半光氨酸定位于碳端，作為人造多肽用于免疫接種小鼠或豬，盡管動物能產(chǎn)生針對這段多肽的抗體，但所產(chǎn)生的抗體不能中和PRRSV[12]。因此，和LDV一樣，PRRSV的中和位點(diǎn)確實(shí)能被中和抗體所識別，但不能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，提示還有其他殘基對誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生起決定作用。

中和位點(diǎn)的突變被稱作抗原漂移，是RNA病毒免疫逃逸的主要機(jī)制。然而，有的病例中和位點(diǎn)定位于具有強(qiáng)致病力的糖蛋白，這些病例中，突變發(fā)生在這些特殊位點(diǎn)對病毒不利，PRRSV正是如此。因此，其他非常規(guī)的感染機(jī)制對PRRSV逃避免疫監(jiān)視并在宿主體內(nèi)持續(xù)存在起重要作用?？刮稽c(diǎn)A的抗體在PRRSV感染早期被誘導(dǎo)產(chǎn)生，而在感染后前30 d不能檢測到抗B位點(diǎn)的抗體[27-28]。因此，認(rèn)為A位點(diǎn)與中和B位點(diǎn)的同時(shí)出現(xiàn)將抑制對中和位點(diǎn)B的反應(yīng)?？怪泻臀稽c(diǎn)B的抗體的延遲產(chǎn)生可以解釋早期研究者所描述的無中和抗體產(chǎn)生的原因，因此，中和抗體延緩產(chǎn)生是PRRSV逃逸免疫監(jiān)視的主要機(jī)制，也是PRRSV感染的主要特征。很多研究表明GP5前導(dǎo)區(qū)存在斷裂位點(diǎn)，用不同的預(yù)測方法，一些研究者推定GP5前導(dǎo)區(qū)斷裂位點(diǎn)在31位~32位氨基酸之間[27-28]，而另一些研究者認(rèn)為在25位~26位氨基酸之間[20]。因此，有人推定很可能在感染后期PRRSV的變異是由糖基化和非常規(guī)的GP5多肽的斷裂引起的，由于在31位~32位氨基酸斷裂造成無位點(diǎn)A，PRRSV含這種類型的分子形式會誘導(dǎo)低水平的抗位點(diǎn)B的免疫反應(yīng)。因此，在持續(xù)感染階段所產(chǎn)生的抗體對清除病毒是無效的，當(dāng)PRRSV發(fā)生突變，致使A位點(diǎn)消失，B位點(diǎn)被識別，誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生，并最終清除病毒。例如，據(jù)最新報(bào)道，親神經(jīng)性PRRSV毒株在GP5的44位氨基酸有N-S突變，這將缺失這個(gè)位置的糖基化。這個(gè)突變與LDV的N-S突變相似，使這個(gè)毒株有親神經(jīng)性同時(shí)使其更易被中和。

在PRRSV攻毒后發(fā)生急性冗長的感染，以病毒血癥為特征，大約持續(xù)30 d，此期間無抗B位點(diǎn)的中和抗體產(chǎn)生，PRRSV開始以非常規(guī)的機(jī)制逃避免疫監(jiān)視。例如，在感染后誘導(dǎo)低水平的α-IFN以降低危險(xiǎn)信號（一般能誘導(dǎo)強(qiáng)烈特異性細(xì)胞反應(yīng)）水平[9]，誘導(dǎo)多克隆擴(kuò)張，以分散特異性抗體反應(yīng)。另外，在攻毒感染后數(shù)周，抗GP5蛋白胞外域抗體處于免疫顯性的核心位置，而不是A位點(diǎn)，很可能是A位點(diǎn)與胞外域的糖基化抑制了B淋巴細(xì)胞特異位點(diǎn)上的IgM識別B位點(diǎn)。當(dāng)PRRSV發(fā)生抗原位點(diǎn)突變，A位點(diǎn)消失，誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生。中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)共同作用終止病毒感染細(xì)胞，并最終根除組織中的病毒。

4 展望

中和抗體在抗PRRSV感染過程中起重要作用，然而延遲誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞免疫和體液免疫,為病毒在宿主體內(nèi)大量復(fù)制，并感染其他易感動物提供了一個(gè)時(shí)間窗口。在這個(gè)過程的晚期，中和抗體和細(xì)胞免疫同時(shí)被誘導(dǎo)，終止病毒感染細(xì)胞，并最終根除組織中的病毒。血清中和抗體水平與B位點(diǎn)特異性B淋巴細(xì)胞的克隆頻率的增長正相關(guān)，再次感染PRRSV將活化這種克隆，并會誘導(dǎo)得更快、產(chǎn)生更多的中和抗體，這已在免疫接種動物攻毒試驗(yàn)中被證實(shí)。因此，理想的PRRS疫苗應(yīng)該在短時(shí)間誘導(dǎo)高水平的中和抗體和特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。

作者：宋志軍等 文章來源：動物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展