三聚氰胺的檢測方法！

韓新華 · 發(fā)表于 2008-10-2 04:53:57

請大家看看這幾種方法對大家是否有用？

韓新華 · 發(fā)表于 2008-10-2 04:56:58

三聚氰胺的檢測方法（山東六和集團）

1 三聚氰胺的性質(zhì)

三聚氰胺簡稱三胺, 別名蜜胺、氰尿酰胺, 分子式:C3N6H6, 分子量: 126.12, 是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料。物理性能: 白色結(jié)晶粉末, 無味, LD50( 半數(shù)致死量) :4550 mg/kg(小鼠經(jīng)口); 3000 mg/kg(大鼠經(jīng)口), 相對密度:1570 kg/m3。熔點: 在常壓下, 354℃分解。升華溫度:300℃。溶解性: 能溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶; 微溶于水、乙醇; 不溶于乙醚、苯和四氯化碳。水溶液呈弱堿性。化學(xué)性能: 三聚氰胺顯弱堿性, 能夠與各種酸反應(yīng)生成三聚氰胺鹽。在強酸或強堿液中, 三聚氰胺發(fā)生水解, 胺基逐步被羥基取代, 生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺與醛類反應(yīng)生成加成化合物。其中三聚氰胺與甲醛水溶液的反應(yīng)是最重要的反應(yīng)。

2 飼料原料中混入三聚氰胺的原因分析

很多飼料廠控制飼料原料時, 基于條件所限, 常用凱氏定氮方法測定粗蛋白的含量, 因為凱氏定氮只能測出含氮量而無法測出氮的來源, 加上蛋白質(zhì)原料價格比常規(guī)的谷物原料要高很多, 為謀取不當(dāng)?shù)美蛷浹a飼料原料中蛋白含量低的問題, 不法商人常常加入非蛋白原料, 如工業(yè)尿素、二脲等非蛋白氮而冒充粗蛋白質(zhì)。對于加入尿素以及尿素類成品可以通過檢測氨氮的方法檢測出來, 而三聚氰胺不溶解在水里, 抗氨氮測定, 所以一般的飼料分析化驗部門也很難分析出來。有時在化驗一些蛋白質(zhì)原料時, 蛋白質(zhì)含量高, 而氨基酸含量低, 也可能是加入三聚氰胺。另外, 三聚氰胺含氮量為66.6%, 折合成粗蛋白含量為416.27%, 摻入少量就可以迅速提高蛋白含量。加上三聚氰胺為白色粉末, 易被染色, 很容易混入原料中而不被發(fā)現(xiàn)。三聚氰胺通常被摻入蛋白飼料中, 如大豆蛋白粉、魚粉、肉骨粉、玉米蛋白粉以及餅粕類原料等。三聚氰胺是一種有機化工產(chǎn)品, 不是國家許可的飼料和食品添加劑, 加入飼料原料中對人和動物產(chǎn)生的危害也在進一步研究中。

3 三聚氰胺的檢測方法

工業(yè)上測定三聚氰胺的純度通常采用苦味酸法和升華法?？辔端岱ǚ椒ㄔ?/font>: 將水加入試樣, 加熱溶解后, 加人苦味酸溶液, 稱量所生成的苦味酸三聚氰胺沉淀的質(zhì)量, 即測得三聚氰胺純度含量。分析步驟: 稱取試樣, 置于500 ml 錐形瓶中, 同時加入水, 加熱溶解; 冷卻后, 加入酚酞指示液3 滴, 若顯色, 加入硫酸溶液, 直至溶液顏色消失, 若有不溶物, 需過濾, 水洗; 把濾液和洗液合并, 移入500 ml 容量瓶中, 加水至刻度, 仔細振搖混合后, 準(zhǔn)確吸取100 ml 置于500 ml 燒杯里; 將此溶液加熱至80℃, 另加入已加熱至80℃的100 ml 苦味酸溶液, 冷卻至室溫后, 保持在15℃以下約8 小時; 用已恒重的玻砂過濾器過濾, 之后,先用約100 ml 苦味酸三聚氰胺的飽和溶液洗滌, 再用水洗; 烘干玻砂過濾器, 置于干燥器中冷卻后, 稱量求得沉淀物質(zhì)量。升華法測定原理: 在升華裝置中將試樣在負壓下進行加熱, 讓三聚氰胺完全升華后, 稱其殘渣量, 即測得三聚氰胺純度。分析步驟: 稱取試樣, 置于預(yù)先干燥了的且已知質(zhì)量的試樣容器里; 將試樣容器置入減壓升華裝置內(nèi),待完全密閉后, 開啟真空裝置緩緩吸引, 并調(diào)節(jié)裝置內(nèi)的

溫度, 經(jīng)2 小時升華結(jié)束; 取出試樣容器, 冷至室溫后, 稱量試樣容器的質(zhì)量。上述兩種測定方法準(zhǔn)確度均較高, 但操作繁瑣, 分析時間太長,有人推薦采用電位滴定法。具體測定方法, 首先測定三聚氰胺溶液中總固體的含量, 稱取樣品于200 ml燒杯中, 加入100 ml 蒸餾水, 放于石棉網(wǎng)的電爐上加熱,在沸騰的情況下攪拌溶液, 使試樣完全溶解。在電磁攪拌狀態(tài)下, 用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定熱溶液至pH 值為5 左右。流水冷卻溶液至室溫, 滴定, 每次準(zhǔn)確加入0.1 ml 硫酸標(biāo)液,并記下相應(yīng)的pH 值, 直至pH 值約為3。計算出等當(dāng)量點時消耗硫酸標(biāo)液的體積。結(jié)果計算按公式Me=S×6.307×V×F /m ( 其中式中:Me 為溶液中三聚氰胺的含量, %; S 為溶液中總固體的含量, %; V 為等當(dāng)量點時消耗硫酸標(biāo)液的體積, ml; F 為0.5 mol /L 硫酸標(biāo)液的校正系數(shù); m 為滴定時所標(biāo)取總固體的質(zhì)量; 6.307 為換算系數(shù)) 。

韓新華 · 發(fā)表于 2008-10-2 05:00:01

飼料中三聚氰胺的測定
1　范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜質(zhì)譜法（GCMS）測定飼料中三聚氰胺的方法。高效液相色譜法為篩選法，氣相色譜質(zhì)譜法為確證法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料，預(yù)混料、濃縮飼料、飼料添加劑、植物性蛋白粉、寵物飼料中三聚氰胺的測定，方法最低定量限高效液相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜法分別為2.0mg/kg和0.05mg/kg，高效液相色譜的最低檢測濃度分別為0.5mg/kg。
2　規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
第一法高效液相色譜法
3　原理
試樣中的三聚氰胺用1％三氯乙酸提取，離心后取部分提取液，用陽離子交換柱凈化，洗脫物用具有二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀進行定量。
4　試劑與材料
除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。水為蒸餾水，色譜用水符合GB/T 6682一級用水的規(guī)定。
4.1 甲醇：色譜純。
4.2 乙睛：色譜純。
4.3 氨水。
4.3 陽離子交換柱(SPE柱)：60mg，3mL或150mg，6mL。
4.4 1％三氯乙酸：稱取10g三氯乙酸溶解于1000mL水中。
4.5 5％氨化甲醇：量取5mL氨水，溶解于100mL甲醇中。
4.6乙酸鉛溶液（ρ（PbAc2）=22g/L）：取22g乙酸鉛用約300mL水溶解后定容至1L。
4.7 濾膜：0.45m，有機相
4.8 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（﹥99.0％）
4.9 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1mg/mL）：稱取100mg（精確到0.1mg）的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇/水（2:8，V:V）溶解并定容于100mL容量瓶中。
4.10 標(biāo)準(zhǔn)工作液：標(biāo)準(zhǔn)工作液按照需要逐級稀釋配制。
5 儀器與設(shè)備
5.1 高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器。
5.2 離心機：10000rpm
5.3 渦旋混合器
5.4 氮吹儀
5.5 固相萃取裝置
5.6 高速勻質(zhì)器
5.7 索式提取器
6 測定步驟
6.1 提取
6.1.1 植物蛋白和飼料中三聚氰胺的提取
稱取5.0g樣品，準(zhǔn)確加入48ml1％的三氯乙酸溶液，加入2mL飽和醋酸鉛溶液。搖勻，超聲提取20min。取提取液約30mL轉(zhuǎn)入離心管，在10000rpm離心機上離心5min。
6.1.2 寵物飼料中三聚氰胺的提取
稱取5.0g樣品，在索式提取器中用乙醚回流6h去除脂肪。脫脂殘渣準(zhǔn)確加入48ml1％的三氯乙酸溶液，加入2mL飽和醋酸鉛溶液。搖勻，超聲提取20min。取提取液約30mL轉(zhuǎn)入離心管，在10000rpm離心機上離心5min。
6.2 凈化
MCX柱活化和上樣：分別用3ml甲醇，3ml水活化MCX柱，準(zhǔn)確移取10mL離心液分次上柱。再用3ml水和3ml甲醇洗滌MCX柱，抽近干后用5％氨化甲醇溶液（4.5）3ml洗脫。洗脫液于氮吹儀上50℃氮吹至干，用2+8甲醇水定容，過0.45m濾膜，濾液用于液相色譜測定。
6.3 測定
6.3.1液相色譜條件
色譜柱：C8柱，1504.6mm(i.d)，5m；
柱溫：室溫
流動相：10+90（乙腈：10mM庚烷磺酸鈉，10mM檸檬酸緩沖液）
檢測波長：240nm
進樣量：20L
根據(jù)試樣中被測物的含量情況，選取響應(yīng)值適宜的標(biāo)準(zhǔn)工作液進行色譜分析，按照保留時間和二極管陣列的紫外光譜進行定性，標(biāo)準(zhǔn)工作液應(yīng)有五個濃度水平。標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi)。
6.4 結(jié)果計算和表述
按照下式計算試樣中三聚氰胺的含量：

式中：
W－試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每公斤（mg/kg）；
V－樣品最終定容體積，單位為克（g）；
c－由標(biāo)準(zhǔn)曲線而得的樣液中三聚氰胺的含量，單位為微克每升（g/L）；
m－試樣量，單位為克（g）。
n — 稀釋倍數(shù)。

6.5 結(jié)果表示
平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

7重復(fù)性
在同一實驗室由同一操作人員使用同一儀器完成的兩個平行測定的相對偏差不大于10%

氣相色譜－質(zhì)譜法（確證法）
8 方法提要
試樣中的三聚氰胺用1％三氯乙酸提取，用陽離子交換柱凈化，用BSTFA衍生化，用氣相色譜-質(zhì)譜進行定性和定量分析。
9 試劑和材料
衍生化試劑：N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）
其他同5
10 儀器和設(shè)備
氣相色譜-質(zhì)譜，其它同6
11 分析步驟
前處理同6.1和6.2
11.1 衍生化
將6.2的凈化液吹干，加入200L的吡啶和200L的BSTFA，混勻，在70℃衍生30min。同時用三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)系列做同步衍生。
測定
11.2 氣相色譜－質(zhì)譜條件
柱子：DB-5MS柱
載氣：He 流速: 1.3 ml/min 平均線性速度: 35 cm/sec 壓力: 17.5 psi (initial) 模式: 恒流
進樣：不分流或分流進樣 (1:20)，進樣體積為1µl，進樣溫度: 250ºC
升溫程序：起始溫度為75ºC，持續(xù)1.0 min，以30ºC/min升溫至300ºC，保持2.0 min。傳輸線溫度為280 ºC。
運行時間: 10.5 min
質(zhì)譜條件：質(zhì)量范圍: 40-450 amu
掃描模式：全掃描 (Electron Ionization)
溶劑延遲: 4.2 min (splitless); 3.8 min (split)
四極桿: 150ºC
離子源: 230ºC
監(jiān)測離子：特征離子 171，99，73；分子離子：327，342
11.3 定性定量方法
定性方法：樣品與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.5%。特征離子基峰百分?jǐn)?shù)與標(biāo)準(zhǔn)品相差不大于20％。
定量方法：選擇離子監(jiān)測（SIM）法計算峰面積，單點或多點校準(zhǔn)法定量。
12 結(jié)果結(jié)算和表述
按照下式計算試樣中三聚氰胺的含量：

式中：
W－試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每公斤（mg/kg）；
V－樣品最終定容體積，單位為克（g）；
c－由標(biāo)準(zhǔn)曲線而得的樣液中三聚氰胺的含量，單位為微克每升（g/L）；
m－試樣量，單位為克（g）。
平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
13 允許差
取平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為測定結(jié)果，兩個平行測定的相對偏差不大于20％。

songping · 發(fā)表于 2008-10-2 10:37:23

國家也在征集好的方法，關(guān)鍵是實用，易操作，氣相液相一般的做不來的

wangliguo429 · 發(fā)表于 2008-10-4 17:26:34

正需要，謝樓主提供:xuehu:

wfcllyb · 發(fā)表于 2008-10-4 18:18:11

方法不錯，但樓主是不是在第三樓將計算公式給忘了！

毅石 · 發(fā)表于 2008-10-5 12:34:57

查過一些文獻，大都用氣相色譜。一般的飼料企業(yè)做不到的！

laomo7909 · 發(fā)表于 2008-10-5 12:53:43

我覺得現(xiàn)在我們已經(jīng)不是研究怎么測三聚氰胺了，最需要研究的是怎么改進測蛋白的方法。在這個摻假橫飛的年代，利用傳統(tǒng)的方法測粗蛋白還能代表什么？只能帶來對人們生活的傷害，國家不顧勞動人們的死活，一生令下，奶牛只能把白白的牛奶給倒掉，只能是讓世界人民看中國人的消化，只能是讓“made in china”成為假貨的代名詞?？杀　?/td>