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廣西野豬豬瘟病毒感染情況的調(diào)查報告

陳鳳蓮,馬玲,潘漢世,黃紅梅,孫建華,陳忠偉,吳健敏

(廣西獸醫(yī)研究所,南寧　530001)

摘要:作者報道采用RT-PCR和ELISA方法檢測豬瘟病毒在野豬身上的感染情況。采集廣西5個地市28份野豬脾淋組
織作病毒檢測,設(shè)計針對豬瘟(classical swine fever, CSF)病毒的特異性引物CSFVE2,進行RT-PCR檢測,所檢樣品結(jié)果全呈
豬瘟陰性;同時,運用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒檢測以上樣品,結(jié)果也都呈陰性。這一結(jié)果初步表明所檢測的廣西5
個地區(qū)的野豬沒有感染豬瘟病毒。
關(guān)鍵詞:豬瘟病毒;野豬;RT-PCR;ELISA
中圖分類號:S852.65+1　　　　　文獻標(biāo)識碼:A　　　　　文章編號:1671-7236(2007)08-0075-03

野豬( sus scrofa)屬于偶蹄目,豬科,主要分布在歐亞大陸的南部,即分布于歐洲、北非和亞洲中
部天山山脈的歐洲野豬,分布于中國大陸、臺灣、爪哇、蘇門答臘和新幾內(nèi)亞的亞洲野豬。近年來,由于野豬獨特的營養(yǎng)價值而備受親睞,野豬資源也逐漸受到保護,如廣東已將野豬列為省重點保護動物。但是,除了對野豬生態(tài)學(xué)和利用方面研究較多外,對其疾病及其在森林生態(tài)環(huán)境中疾病控制方面的研究報道甚少。
豬瘟(classical swine fever ,CSF)是嚴(yán)重危害
全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病,是我國主要的畜禽疫病之一。近年來本病以多種形式發(fā)生,非典型豬瘟(雷夢珍,1995)、繁殖障礙、新生仔豬先天性感染(王雯慧等,2000)等,給本病的診斷與防控帶來很大的困難。野豬是豬瘟病毒的自然貯存宿主,野豬中存在
CSFV的持續(xù)感染,目前為止仍然是歐盟國家爆發(fā)豬瘟的最重要傳染源(涂長春,2003),因而也是歐盟各國控制消滅CSFV首要考慮的因素之一。我國野豬資源豐富,目前為止尚未見到開展野豬感染豬瘟的調(diào)查報道,因此我國野豬中是否也存在CSFV感染,是豬瘟防控工作中急待了解的問題。因此,開展野豬中CSFV感染的情況調(diào)查,對我們了解CS-FV的生態(tài)環(huán)境,制定CSFV的控制與凈化措施,開發(fā)野豬資源等都具有十分重要的意義。本試驗用RT-PCR技術(shù)和ELISA方法檢測來自廣西境內(nèi)5個山區(qū)市縣的28份野豬組織材料,以了解廣西境內(nèi)野豬CSFV的感染情況,現(xiàn)將結(jié)果報道如下:
1　材料和方法
1.1　野豬檢測材料　2006年采自廣西崇左、河池、柳州、百色、梧州5個市(縣)野外捕殺野豬的脾臟與淋巴結(jié),共28份(其中有3份為1998年采集,來自百色田林縣)。1.2　主要試劑　M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶購自Promega公司;Trizol購自Invitrogen公司; dNTPs、DL2000 DNA Marker、RNasin等購自TaKaRa公司。豬瘟抗原檢測試劑盒(ELISA檢測試劑盒)為美國IDEXX公司產(chǎn)品。
1.3　引物合成　根據(jù)已發(fā)表的CSFV Alfort株的E2基因序列(Meyers等,1996),設(shè)計了1對簡并引
物:CSFV-F:5’-TC(GA)(AT)CAACCAA(TC) GAGATAGGG-3’;CSFV-R:5’-CACAG(CT)CC (AG)AA(TC)CC(AG)AAGTCATC-3’,預(yù)期擴增目的片段長度約為216 bp。由北京博邁德生物技
術(shù)有限責(zé)任公司合成。
1.4　材料中總RNA的抽提　取大約1 g上述野豬脾、淋組織,于研磨器充分研磨,用Hanks液1∶5稀釋,反復(fù)凍融3次,8000 r/min離心10 min,取上清液400μl,加入800μl Trizol,混勻后室溫放置
5 min。加入200μl氯仿,旋渦振蕩15 s混勻,室溫下放置2~3 min,12000 r/min離心10 min。取上
清轉(zhuǎn)移到新的EP管,再加入500μl異丙醇混勻,室溫下放置10 min。12000 r/min離心10 min,棄上
清,再加入75%酒精1000μl,旋渦振蕩混勻,12000r/min離心5 min,晾干,用適量無Rnase水溶解
RNA,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/font>
1.5　病毒cDNA合成　取16μl上述RNA與1μlCSFV-R引物混勻,于PCR儀中70℃5 min,90℃
5 min后,立即冰浴5 min。在上液中加入如下試劑:5×RT buffer 5μl,dNTP ( 2.5 mmol/L) 4μl, RNasin 0.5μl, M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl,混勻后置PCR儀中42℃反轉(zhuǎn)錄1 h后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/font>
1.6　CSFVE2基因片段的擴增　PCR反應(yīng)體系為25μl ,各成分如下:10×PCR buffer 2.5μl,dNTP
(2.5 mmol/L) 2.5μl,CSFV-F和CSFV-R(2.5pmol/L)各0.5μl,cDNA模板2.0μl,0.25μTaqDNA聚合酶(5 U/ul),加H2O至25μl。PCR反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性3 min;94℃1 min,56℃1 min,72℃1 min,35個循環(huán); 72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察目的片段。1.7　ELISA方法檢測豬瘟抗原　除了選用其中20份野豬脾、淋組織外,還選取了3份由本室保存的豬瘟陽性病料一同進行檢測。具體操作按試劑盒說明書進行。首先在每孔中加入25μl CSFV特異性單克隆抗體;然后再加入75μl制備的樣品,混勻;置濕盒,室溫孵育過夜;用洗滌液洗滌5次后,在每孔中加入100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記物,濕盒中孵育1 h;再用洗滌液洗滌5次,于每孔加入100μl底物液,在暗處室溫孵育10 min后,每孔加入100μl終止液終止反應(yīng),最后在酶標(biāo)儀上測量樣品在450 nm處的OD值。本試驗設(shè)立2孔陰、陽性對照。結(jié)果判定:被檢樣品校正OD值≥0.300,判為陽性;校正OD值<0.200判為陰性;校正OD值在0.200~0.300之間判為可疑。OD值校正方法見說明書。
2　結(jié)果
2.1　RT-PCR對野豬脾、淋組織的檢測結(jié)果　采用RT-PCR技術(shù),利用CSFV特異性引物,對5個地區(qū)28份野豬材料及2份豬瘟陽性病料進行擴增。結(jié)果陽性對照在約216 bp處擴增出CSFVE2基因目的片段,而所有被檢野豬組織均沒有擴增出CSFV目的片段,初步表明所檢測的野豬被檢樣品沒有檢測到CSFV(圖1為部分被檢樣品結(jié)果)。2.2　ELISA方法對野豬組織樣品的檢測結(jié)果　為
了進一步驗證上述RT-PCR的檢測結(jié)果,再采用美國IDEXX公司豬瘟ELISA抗原檢測試劑盒,對野
豬樣品進行檢測,結(jié)果除了3份豬瘟陽性病料檢測的OD值大于0.3以外,其余20份野豬材料檢測的OD值均小于0.2(表1),CSFV檢測陰性。由此進一步說明這些野豬沒有受到CSFV感染。
3　討論與小結(jié)
國外有報道(Kaden等,1999)認為在豬瘟病毒的檢測方法中,RT-PCR和病毒分離是目前敏感性
較高的試驗方法,ELISA診斷方法次之。由于病毒分離的試驗周期較長,且成功率不高,所以目前多采用RT-PCR。本試驗在運用RT-PCR檢測的基礎(chǔ)上,再用IDEXX公司豬瘟Ag-ELISA檢測試劑盒,
對來自廣西5個山區(qū)市(縣)的28份野豬材料進行檢測,結(jié)果全部為陰性,2種檢測方法結(jié)果一致,初
步說明廣西這些區(qū)域的野豬(野生)沒有受到CSFV的感染。豬瘟是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一,是世界各國重點防制的動物疫病。每年都投入巨大的防制經(jīng)費,制定并采取嚴(yán)密的防控措施。我國是豬瘟的老疫區(qū),豬瘟的問題長期困擾著我國的養(yǎng)豬業(yè),如何控制凈化豬瘟病毒是擺在我們面前一個長期而艱巨的任務(wù)。涂長春課題組經(jīng)過大量艱苦細致的工作,發(fā)現(xiàn)我國豬瘟病毒的流行毒株分為2個基因群,
4個基因亞群,其中基因2群屬優(yōu)勢基因群,它們與歐洲流行的2群病毒甚至和流行于歐洲野豬群中的毒株在遺傳上有親緣關(guān)系。但到目前為止,我國野豬中是否存在豬瘟病毒感染仍未見報道。盡管本試驗因條件限制,采樣地區(qū)狹小,樣品數(shù)量有限,但也能反映一定的問題。因此,我們的調(diào)查結(jié)果
不但豐富了我國豬瘟病毒流行病學(xué)、生態(tài)環(huán)境的資料,而且對制定豬瘟控制與凈化措施具有重要
的指導(dǎo)作用。
參考文獻
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