瓊脂擴散法檢測卵黃抗體效價影響因素的分析

登高遠(yuǎn)眺 · 發(fā)表于 2009-2-1 08:26:34

瓊脂擴散法檢測卵黃抗體效價影響因素的分析
      摘要：抗體瓊脂擴散試驗是當(dāng)前卵黃抗體效價測定的主要方法之一，該方法簡潔、快速非常適合于臨床中應(yīng)用，但是該方法容易受到多種因素的影響而導(dǎo)致試驗結(jié)果判斷的不準(zhǔn)確。本文就瓊脂擴散試驗中抗原抗體本身性質(zhì)、反應(yīng)特點、最適比例、可逆性、總量以及瓊脂、水等所有能影響試驗結(jié)果的因素進行了逐一分析。
關(guān)鍵詞：卵黃抗體；瓊脂擴散試驗；影響因素
卵黃瓊脂擴散試驗是通過抗原、卵黃抗體在瓊脂凝膠中由近及遠(yuǎn)不斷自由擴散形成濃度梯度，在適當(dāng)比例處相遇形成沉淀線，并由此來判斷抗體的效價的一種技術(shù)。瓊脂擴散試驗主要是用于可溶性膠原性抗原及其所對應(yīng)抗體水平的檢測，獸醫(yī)臨床中主要用于法氏囊、新城疫等抗體效價的檢測。由于卵黃內(nèi)抗體效價與雞體內(nèi)的效價幾乎相同，所以我們通過瓊脂擴散試驗測定卵黃抗體的效價，可以在不刺激雞體的情況下就可知道產(chǎn)蛋雞的抗體水平和免疫效果。卵黃瓊脂擴散試驗操作簡單、所用的儀器少、結(jié)果易判斷，因此被越來越多的養(yǎng)殖戶、獸醫(yī)工作者所采用，成為他們制定產(chǎn)蛋雞免疫程序的主要依據(jù)。但是瓊脂擴散試驗的結(jié)果容易受到抗原抗體因素、瓊脂、反應(yīng)條件以及其它因素的影響而導(dǎo)致抗體效價測定不準(zhǔn)確。為了能使臨床中廣大實驗操作人員對瓊脂擴散試驗?zāi)苡幸粋€更深刻的認(rèn)識，現(xiàn)將以上各種影響因素分析如下。
1抗原抗體因素
  瓊脂擴散試驗受抗原抗體本身性質(zhì)、抗原抗體反應(yīng)特點及其它因素的直接影響。
1.1抗原抗體的性質(zhì)
1.1.1抗體性質(zhì)：抗體的特異性與親和力是影響瓊脂擴散試驗的主要因素?？贵w的特異性是由抗體可變區(qū)的原子空間排列以及它們的電子結(jié)構(gòu)和極化特性決定的，親和力是復(fù)雜抗原與相應(yīng)抗體之間的總的結(jié)合能力?？贵w的親和力很低時不易用瓊脂擴散試驗測定。一般情況下，在免疫初期，卵黃抗體的特異性較高但親和力不高，后期，卵黃抗體的親和力高但相應(yīng)的特異性變低。
1.1.2抗原性質(zhì)：抗原的種類、抗原決定簇的數(shù)目和理化性質(zhì)等因素都能影響瓊脂擴散試驗的結(jié)果。瓊脂擴散試驗是利用可溶性的抗原與抗體在瓊脂凝膠網(wǎng)格中的水中自有擴散，相互結(jié)合形成的沉淀線來判斷結(jié)果的。這樣就要求抗原與抗體必須都是可溶性的，因為一些顆粒性的抗原如細(xì)菌、紅細(xì)胞等是不溶的，這樣的抗原相對應(yīng)的卵黃抗體效價就不能用瓊脂擴散試驗來測定。在瓊脂擴散試驗中要求抗原是多價的（抗原決定簇≥2），單價抗原不能形成抗原抗體復(fù)合物，因此不能產(chǎn)生可見反應(yīng)?？乖姆肿恿?、PH值等理化因素也直接影響到實驗的結(jié)果。
1.2抗原抗體的反應(yīng)特征  抗原抗體反應(yīng)特征影響瓊脂擴散試驗結(jié)果的因素有:抗原抗體最適比、抗原抗體反應(yīng)的可逆性、抗原抗體的量。
1.2.1抗原抗體的最適比[3]：抗原抗體的反應(yīng)雖決定于兩者的化學(xué)構(gòu)型的相應(yīng)性，但不同于一般的化學(xué)反應(yīng)，其結(jié)合比例不完全符合化學(xué)反應(yīng)的質(zhì)量作用定律，因為抗原抗體的結(jié)合是一種多價相互作用的結(jié)合?？乖鶕?jù)分子大小的不同，結(jié)合位點變化很大，由10－50不等，有的甚至達到200個；卵黃中的抗體成份主要是IgG，有兩個結(jié)合位點，卵黃抗體除了常見的雞傳染性法氏囊炎抗體外，還有鴨病毒性肝炎、豬瘟[4]等高免卵黃抗體，這些抗體的效價都可以用瓊脂擴散試驗來測定。當(dāng)抗原抗體的濃度比例適宜時，抗原抗體結(jié)合后尚未達到飽和的位點可與其它游離的抗原抗體繼續(xù)結(jié)合，逐漸形成越來越大的復(fù)合物。最后在抗原與抗體孔之間形成肉眼可見的沉淀線。此時反應(yīng)最快、最明顯。但當(dāng)兩者的量不適合時，少的一方在聚合初期就達到飽和，沉淀線變得不清晰甚至沒有沉淀線，而且沉淀線偏移，向量少的一方移動。
1.2.2抗原抗體反應(yīng)的可逆性[3]：抗原抗體之間的結(jié)合是依靠分子間的近距離力：氫鍵、范德華力、靜電力、疏水作用力。兩者的距離越近，結(jié)合的位點越多，形成的近距離力也越大，結(jié)合的也越牢固。這些作用力在生理狀態(tài)下最大。由于抗原抗體反應(yīng)是分子表面的非分子結(jié)合，所形成的復(fù)合物并不牢固，可以隨時解離，解離的抗原抗體保持原來的生物活性，可與其它的抗原抗體再一次結(jié)合，在整個反應(yīng)體系中形成動態(tài)平衡，平衡式為：Ag+Ab≒AgAb。這種平衡易受到溫度、PH等物理的、化學(xué)的因素的影響而改變。當(dāng)溫度大于60℃，PH值降到3以下時，由于同離子效應(yīng)等因素，使抗原抗體蛋白質(zhì)的近距離力遭到破壞，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物重新解離。
1.2.3抗原抗體的總量：瓊脂擴散試驗中所形成的沉淀線的粗細(xì)、清晰度與抗原抗體的量成正比例關(guān)系。因為我們這篇文章主要是討論影響卵黃抗體效價測定的因素，所以主要考慮影響抗原的外界因素。抗原反復(fù)凍溶以及長期把它放在室溫下都能使大量的抗原破裂失去活性。所以在保存與運輸抗原時應(yīng)放在冷凍條件下進行。
1.3抗原抗體的純度：抗原與其對應(yīng)的抗體的反應(yīng)屬于特異性反應(yīng)。但是如果兩者含有過多與反應(yīng)無關(guān)的蛋白質(zhì)、類脂質(zhì)、多糖等非特異性物質(zhì)，往往抑制抗原抗體的特異性反應(yīng)，而出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)。
2瓊脂因素
瓊脂擴散試驗的結(jié)果在很大程度上也受到瓊脂的成份、瓊脂板厚度、瓊脂的濃度、實驗用水質(zhì)量、PH值、電解質(zhì)濃度、抗原抗體孔間距離及瓊脂水分的影響。
2.1瓊脂的成份：影響瓊脂擴散試驗結(jié)果的瓊脂成份因素主要是不溶性雜質(zhì)。一些大的不溶性雜質(zhì)能直接堵塞瓊脂的網(wǎng)格，這樣的雜質(zhì)過多會影響抗原抗體的擴散，為了避免這些雜質(zhì)的影響，應(yīng)在瓊脂粉融化后用脫脂棉或紗布過濾，或者選擇高質(zhì)量的瓊脂粉加工瓊擴板。
2.2瓊脂板的厚度：瓊脂板的厚度應(yīng)為3mm左右，因為由于重力作用，加入孔中的抗原抗體會發(fā)生沉淀，導(dǎo)致上下層的濃度形成差，濃度大的向瓊脂網(wǎng)格中擴散的速度要比濃度小的快，同時又由于抗原抗體的質(zhì)量與體積的差異，所以兩者形成的濃度差是不同的，擴散速度的差異也不同，如果瓊脂板很厚，同一孔上下層擴散速度差異及抗原抗體之間擴散速度的差異都很大，致使抗原抗體孔之間形成的沉淀線上下層之間就不在同一平面上，影響瓊脂擴散試驗的結(jié)果的觀察；相反如果瓊脂板太薄，所加的抗原抗體量很小，沉淀線不清晰甚至不出現(xiàn)沉淀線。
2.3瓊脂的濃度：瓊脂凝膠網(wǎng)格允許通過物質(zhì)的最大分子量與瓊脂濃度成反比（見表1），卵黃抗體IgG的分子量為1.8×105[5],1％－1.5％的瓊脂溶液網(wǎng)格能允許絕大多數(shù)大分子抗原自由擴散，大于這個濃度范圍的瓊脂網(wǎng)格太小不利于大分子抗原如雞馬立克氏病病毒（分子量為1.03×108）、雞傳染性喉氣管炎病毒[6]的擴散，濃度太小瓊脂骨架太少不利于抗原抗體復(fù)合物的沉淀，從而影響瓊脂擴散試驗的結(jié)果。`
表1瓊脂糖凝膠Bio-Gel A型的數(shù)據(jù)[7]
型號  Bio-Gei A瓊脂糖含量%分級范圍（球蛋白）
A-0.5m101×104～5×105
A-1.5m81×104～1.5×106
A-5m61×104～5×106
A-15m44×104～1.5×107
A-50m21×105～5×107q
A-150m11×106～1.5×108
2.4實驗用水的質(zhì)量：瓊脂擴散試驗的結(jié)果在很大程度上也受到實驗用水的影響。如果實驗用水中含大量重金屬離子如鉛、汞、銅等，會使蛋白質(zhì)成份的抗原抗體變性失去活性，不能再發(fā)生特異性反應(yīng)，影響瓊脂擴散試驗的結(jié)果。
2.5 PH值：抗原抗體大部分是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在一定的PH處所帶的凈電荷數(shù)為零，此時的PH值為蛋白質(zhì)的等電點，大部分蛋白質(zhì)的等電點在PH5-5.5之間，在等電點處，蛋白質(zhì)分子之間靜電斥力減少，趨于凝集狀態(tài)而發(fā)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點處的溶解度最低。當(dāng)瓊脂的PH在抗原抗體等電點處時，抗原抗體會發(fā)生非特異性的沉淀，影響瓊脂擴散試驗的實驗結(jié)果。一般瓊脂擴散試驗的PH為6－8（比等電點稍高）[2]。當(dāng)PH小于3時，往往使抗原抗體結(jié)合物變性或再次解離，如IgG在PH4.0－11.0穩(wěn)定，馬立克氏病毒在PH3或PH11處理10分鐘失活[6]。見本文1.1.2。
2.6電解質(zhì)的濃度：電解質(zhì)的濃度對瓊脂擴散試驗的結(jié)果影響也很大?？乖贵w具有膠體性質(zhì)，含有氨基、羧基、肽鏈等極性基團，與水相互結(jié)合，形成水化層，因為蛋白質(zhì)帶有相同的電荷，所以膠體所帶電荷相同，互相排斥，在水中穩(wěn)定存在，抗原抗體帶有相反的極性，等兩者結(jié)合后，表面的電荷減少或消失，水化層也減弱，由親水型變?yōu)槭杷?，此時如有適當(dāng)濃度的電解質(zhì)，能進一步降低抗原抗體表面的電荷，促進他們沉淀，最常用的電解質(zhì)為氯化鈉，哺乳動物血清學(xué)反應(yīng)濃度為0.15mol，即生理鹽水，禽類8％[8]。但過高濃度的電解質(zhì)反而不利于抗原抗體沉淀物的形成，有兩個原因：○1過高濃度的電解質(zhì)阻止蛋白質(zhì)與水分子的相互作用，破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，使抗原抗體發(fā)生非特異性的沉淀。○2過高濃度的電解質(zhì)濃度（大于或等于15％）可使抗原抗體結(jié)合物離解。見本文1.1.2。
2.7孔間距離：抗原抗體的孔間距離也能影響瓊脂擴散試驗的結(jié)果。當(dāng)兩者之間的孔距為3mm時，抗原抗體既能形成合適的濃度梯度又能充分結(jié)合。當(dāng)兩者的孔間距離過大時，雖然能形成合適的濃度梯度，但由于抗原抗體量太少卻不能充分結(jié)合，相反孔距太小，雖然結(jié)合的量很大卻不能形成合適的濃度梯度，都能影響瓊脂擴散試驗的結(jié)果。
2.8瓊脂水分：瓊脂凝膠網(wǎng)格內(nèi)含有大量水分，如果瓊脂板儲存時間太長或儲存環(huán)境太干燥又沒有放在密閉環(huán)境中，水分就會大量的揮發(fā)，直接影響抗原抗體擴散的效果。
3抗原抗體反應(yīng)條件
  一些培養(yǎng)條件如反應(yīng)溫度、反應(yīng)濕度、反應(yīng)時間也是影響瓊脂擴散試驗結(jié)果的重要因素。
3.1反應(yīng)溫度  影響瓊脂擴散試驗結(jié)果的溫度因素包括:反應(yīng)溫度的高低與反應(yīng)溫度波動情況。
3.1.1反應(yīng)溫度的高低：抗原抗體的反應(yīng)速度、結(jié)合程度與反應(yīng)溫度高低有密切關(guān)系。溫度高，分子運動加快，增加抗原抗體碰撞幾率，反應(yīng)會加快，但當(dāng)溫度超過56℃時反應(yīng)速度反而變慢，溫度再高，抗原抗體復(fù)合物往往會重新解離，甚至?xí)黄茐?。例如卵黃抗體在≥65℃情況下性質(zhì)就會變得不穩(wěn)定，雞馬立克氏病毒從感染雞皮膚中制備的脫離細(xì)胞制劑在56℃處理30分鐘或在60℃處理10分鐘都能失活，傳染性法氏囊炎病毒在70℃處理30分鐘失活[6]。反應(yīng)溫度低時，反應(yīng)速度變慢，但抗原抗體結(jié)合完全，沉淀量增多，結(jié)果清晰。但溫度過低，反應(yīng)無法進行，也不會出現(xiàn)結(jié)果。最適的反應(yīng)溫度為37℃[8]。
3.1.2反應(yīng)溫度的波動情況:瓊脂擴散試驗的培養(yǎng)溫度應(yīng)恒定，如果波動太大，會使抗原抗體在擴散時形成不連續(xù)的濃度梯度，影響兩者產(chǎn)生最適比，最終影響到實驗結(jié)果。
3.2空氣濕度：瓊脂擴散試驗是抗原抗體在瓊脂網(wǎng)格中的水中擴散時形成的結(jié)果，如果空氣中濕度太低，瓊脂中的水分很容易蒸發(fā)，使瓊脂網(wǎng)格中的水分減少，不利于抗原抗體的自由擴散，同時加到瓊脂孔中的抗原抗體的水分也很容易蒸發(fā)，使卵黃中的抗體及抗體被固定在孔中不容易向瓊脂凝膠中擴散。所以在培養(yǎng)時，往往倒置平皿，然后放在一個有濕棉紗布的有蓋搪瓷盤中，以防水分蒸發(fā)。
3.3反應(yīng)時間：抗原抗體在瓊脂中的擴散需要一定時間。如果反應(yīng)時間太短，使抗原抗體沒有完全擴散以致結(jié)合的不充分或結(jié)合后還沒有達到沉淀的程度，導(dǎo)致本應(yīng)形成的沉淀線沒有出現(xiàn)；時間太長，在室溫條件小，大量抗原抗體會失去生物活性，已經(jīng)形成的沉淀帶發(fā)生解離消失而出現(xiàn)假像。
4其他因素
抗原抗體加的多少、打孔后瓊脂底部融封效果都能影響瓊脂擴散試驗的結(jié)果，本文1.3所述。當(dāng)抗原抗體的量加的多時，所產(chǎn)生的沉淀線粗，為了減小各個實驗的相對誤差，加樣時，都應(yīng)加到滿而不溢程度。此外，打孔后瓊脂板底部松動，如果不加熱封好，在實驗過程中，抗原抗體就不通過瓊脂網(wǎng)格擴散，而是直接在底部流出，不會產(chǎn)生沉淀線。
總之，瓊脂擴散試驗?zāi)苡行У闹笇?dǎo)養(yǎng)殖戶、獸醫(yī)工作者制定合理的免疫程序，但是由于受到以上諸多因素的影響，因此，為了得出真實的實驗結(jié)果，操作者應(yīng)本著科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度進行操作，以克服不良因素的影響。