大環(huán)內(nèi)酯類藥物愛樂新體外抑制歐洲型和北美型藍耳病毒的復制

登高遠眺

大環(huán)內(nèi)酯類藥物愛樂新體外抑制歐洲型和北美型藍耳病毒的復制


豬繁殖與呼吸綜合征是一種對現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟意義的疾病—僅美國每年就造成了數(shù)億美元的損失Neumann et al．，2005)。該病的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(藍耳病病毒)，它是一種動脈炎病毒，主要在肺泡巨噬細胞內(nèi)復制。該病可以感染各種年齡的豬只，但呼吸癥狀通常出現(xiàn)在青年豬。生殖癥狀見于后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬，表現(xiàn)為流產(chǎn)、木乃伊胎、產(chǎn)下不能正常發(fā)育的弱仔。在妊娠最后的三個月里，如果易感的懷孕母豬感染了藍耳病毒將特別容易導致這些生殖癥狀。藍耳病毒污染的精液可以將該病傳染給母豬。
豬繁殖與呼吸綜合征于l987年首次在美國報導，不久以后歐洲也出現(xiàn)該病。血清學調(diào)查表明加拿大的豬只在20世紀70年代感染此病(Rossow，1998)，在歐洲Wensvoort等首次分離到這種病毒(1991)，在美國由Collins等分離到(1992 0有意思的是美洲和歐洲分離株存在基因組和抗原性的差異。當進行氨基酸比對時，兩個毒株病毒表面的主要糖蛋白的差異達到40％。所以將這種病毒分類為1型(歐洲型)和2型(美洲型)。為什么一個全新的病毒在兩個大陸沿著不同的譜系進化?為什么它們又幾乎在同一時間發(fā)病?這些問題都有待解決。Hanada等(2005)提出，這種病毒大概在上世紀80年代從其他物種感染到了豬體，而且直到現(xiàn)在這種病毒還在改變著它糖蛋白上的跨膜區(qū)以適應豬體。有報道稱PRRSV在所有檢測過的RNA病毒當中進化速度是最快的。在其他的動脈炎病毒中，鼠的乳酸脫氫酶增高癥病毒和藍耳病毒存在較近的親緣關系。
這種病毒高突變率的原因就是在這兩種類型的PRRSV存在巨大的基因和抗原性差異。Stadejek等(2002)報道了東歐的l型PRRSV毒株和其他的l型PRRSV之間的差別。根據(jù)早期的田間分離株研發(fā)的PRRSV疫苗初期證明很有效，但是野毒株的基因差異降低了疫苗效果?；钜呙缈梢詼p少野毒株造成的病毒血癥，盡管還是可以從扁桃體分離出PRRSV。滅火苗似乎效果有限，即使被用來抵抗同源毒株的攻毒實驗也效果欠佳(Zuckermann et al．，2007)。1型PRRSV疫苗不保護2型野毒的攻擊(van Woensel et al．，l998 0疫苗株和野毒株的同時感染也是可能的。
替米考星可能有抗藍耳病病毒的效果(Molitoret al．，2001，Benfield et al．，2002)。愛樂新是一種大環(huán)內(nèi)酯類的抗生素，學名叫萬樂霉素。以前發(fā)表的文獻(Stuart et al．，2007)表明萬樂霉素進入細胞并在胞內(nèi)蓄積的速度比替米考星更快。泰樂菌素是另一種大環(huán)內(nèi)酯類，它的胞內(nèi)蓄積效果很差。本實驗的目的就是研究這三種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在體外抗PRRSV的效果。
1材料與方法
1．1細胞系
由英國的吉米·格雷博士贈送的MAl04細胞。在格拉斯哥培養(yǎng)基里添加10％的胎牛血清，100單位的青霉素(Invitrogen公司)和l00μg／mL的鏈霉素(Invitrogen公司)。
1．2藍耳病病毒株
歐洲株(1型)，DV株(英特威公司)為市場上購買的疫苗株。將此毒株在MAl04細胞上進行擴繁培養(yǎng)。存貯培養(yǎng)的病毒滴度為l08空斑形成單位／毫升。美洲型(2型)毒株，VR2332(Benfield et al．，1992)，來自美國標準菌種庫(ATCC。35℃下在MAl04細胞上擴繁病毒(按照菌種庫的要求)存儲培養(yǎng)物的滴度為5×107空斑形成單位／mL。
1.3大環(huán)內(nèi)酯抗生素
由伊科動物保健公司提供的口服用愛樂新溶液。該商品含有抗生素萬樂霉素。替米考星預混劑Pulmotil(含有250m9／mL的鹽酸替米考星)和Tylan(含l9／g泰樂菌素)均購買自Elanc0動物保健公司。
1.4測定三種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗藍耳病效果

將105MAl04細胞在24孔板上培養(yǎng)。將24孔板在37℃下過夜培養(yǎng)。37℃下用不同濃度的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素處理4h時。在抗生素孵育的細胞里，用10空斑形成單位每個細胞的感染復數(shù)分別感染1型和2型藍耳病毒。細胞在適合的溫度下培養(yǎng)20h，然后用4％(體積比)的甲醛／鹽酸鹽緩沖液固定。用間接免疫熒光來測定感染情況。
1．5免疫熒光
在室溫下用0．2％的Triton X—I00／PBS處理細胞5min以增加其滲透性。用單克隆抗體檢測l型藍耳病毒的核衣殼蛋白，單克隆抗體由瓦格寧根大學的Michael Kroese博士惠贈。2型藍耳病毒用單克隆抗體2D6來檢測病毒的核衣殼蛋白?？贵w分別按1／10和1／500的比例溶解在0．2％胎牛血清的PBS中，在室溫放置30min。將樣品用PBS—NCS洗滌兩次。第二抗體是羊抗鼠IgG，將其偶聯(lián)到Alexa Flu—or 488(Invitrogen公司)，在室溫條件下以l／1000的比例加入到PBS—NCS中，孵育30min。將樣品用PBS—NCS洗滌2次。用含有DAPI(4，6一二脒基一2一苯基吲哚鹽酸鹽)的封固劑(Invitrogen公司)將培養(yǎng)板的蓋子封閉在載板上，然后用共聚焦顯微鏡觀察。所有的細胞都用DAPl染色，藍耳病毒陽性的細胞用熒光染色。
1．6吖啶橙細胞染色
將105MAl04細胞接種培養(yǎng)到24孔板內(nèi)。將24孔板在37。C下過夜。在不同的濃度下用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素處理細胞4h，或者不做處理。加水配制成2mol／L的吖啶橙儲備樣品(Invitrogen公司)并加到組織培養(yǎng)基內(nèi)，達到最終濃度為20μmol／L。將細胞在室溫下孵育lh，然后用PBS洗兩次。移除培養(yǎng)板蓋子后立刻放在載玻片上。用共聚焦顯微鏡來進行觀察。在酸性的細胞區(qū)域(次級內(nèi)體和溶酶體)不見綠色熒光，他們呈現(xiàn)紅色熒光，對20個細胞內(nèi)的紅色熒光點進行計數(shù)，把它們的平均數(shù)量排列成圖表。
2結(jié)果與分析
2．1大環(huán)內(nèi)酯類的抗病毒效果
愛樂新和替米考星對1型藍耳病毒感染的抑制效果。用愛樂新處理過的MAl04細胞減少了PRRSV抗原的表達。每次處理后，表達PRRSV抗原的細胞數(shù)僅僅是細胞總數(shù)的一部分。當使用愛樂新的濃度為0．1μg／mL的時候，l型藍耳病的復制降低了將近50％。替米考星也有抗病毒作用，雖然在濃度為0．1μg／mL的時候并沒有抑制效果，但是當濃度為lμg／mL的時候PRRSV陽性細胞數(shù)減少到了50％。當替米考星濃度為l0μg／mL細胞有毒性作用。泰樂菌素沒有抗病毒作用，即使在濃度達到100μg／mL的時候也沒有效果。
用愛樂新和替米考星將MAl04細胞在特定的濃度下處理4h，然后用l型PRRSV(DV株)感染，感染復數(shù)為10~20h后固定細胞，用間接免疫熒光檢測病毒感染的細胞，綠色熒光為病毒的核衣殼蛋白，紅色熒光為α一微管蛋白。
按前文的方法將MAl04細胞用抗生素處理并進行病毒感染。20h后固定細胞，用間接通過免疫熒光的方法來檢測病毒核衣殼蛋白，以此來檢測病毒感染的細胞。用DAPI(4，6一二脒基一2一苯基吲哚鹽酸鹽)將細胞核染色后計數(shù)，從而算出細胞感染率的百分比。
用2型PRRSV(美洲株)進行實驗時也得到了相同的結(jié)果，在使用0．1μg／mL愛樂新的時候，可以將PRRSV陽性細胞的數(shù)量減少到約50％，愛樂新濃度為l0μg／mL的時候，PRRSV陽性細胞數(shù)降到了2％以下。替米考星濃度為lμg／mL的時候可以把PRRSV陽性細胞數(shù)降到約50％，泰樂菌素在濃度為lμg／mL的時候沒有抑制藍耳病病毒復制的功能。
MAl04細胞用抗生素處理，然后感染2型藍耳病毒(VR一2332株)。20h后固定細胞，用間接免疫熒光的方法來檢測病毒感染的細胞，DAPl細胞核染色后計算感染細胞的百分比。
2．2大環(huán)內(nèi)酯類對內(nèi)體pH值的影響
為了檢測愛樂新抗病毒效果的機制，本文作者研究了愛樂新和其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物是否對內(nèi)體的pH值有影響。使用吖啶橙作為酸性細胞器的指示劑。

MAl04細胞中吖啶橙染色的次級內(nèi)體／溶酶體的平均數(shù)如圖4所示。使用泰樂菌素時，濃度達到100μg／mL的時候也不會減少經(jīng)吖啶橙染色的次級內(nèi)體數(shù)，但是在培養(yǎng)基中替米考星的濃度為1．0μg／mL的時候可以觀察到吖啶橙染色的次級內(nèi)體數(shù)有略微的減少。0．1μg／mL濃度的愛樂新少量的減少了酸|生內(nèi)體的數(shù)量，單個細胞中，呈紅色的次級內(nèi)體／溶酶體的數(shù)量從73減少到了68。當愛樂新在培養(yǎng)基中的濃度為l．0μg／mL時就大大的減少了酸性內(nèi)體的數(shù)量，每個細胞中酸性內(nèi)體的數(shù)量僅為10。
用愛樂新、泰樂菌素、替米考星處理MAl04細胞，在特定的濃度下處理4h。然后用2μmol／L的吖啶橙處理lmin。將細胞樣品用PBS洗下來放到載玻片上，然后用共聚焦顯微鏡進行觀察。吖啶橙染色的細胞呈綠色熒光，而酸性的細胞器如次級內(nèi)體／溶酶體呈紅色熒光。按前文提到的方法用大環(huán)內(nèi)酯類處理MAl04細胞，然后進行吖啶橙染色。對每個細胞中的紅色熒光細胞器進行計數(shù)，算出在每組抗生素特定濃度下的平均值。

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謝謝您寶貴的試驗資料。請問泰樂菌素殺毒道理何在？？