大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物愛(ài)樂(lè)新體外抑制歐洲型和北美型藍(lán)耳病毒的復(fù)制

登高遠(yuǎn)眺

大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物愛(ài)樂(lè)新體外抑制歐洲型和北美型藍(lán)耳病毒的復(fù)制


豬繁殖與呼吸綜合征是一種對(duì)現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟(jì)意義的疾病—僅美國(guó)每年就造成了數(shù)億美元的損失Neumann et al．，2005)。該病的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(藍(lán)耳病病毒)，它是一種動(dòng)脈炎病毒，主要在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。該病可以感染各種年齡的豬只，但呼吸癥狀通常出現(xiàn)在青年豬。生殖癥狀見(jiàn)于后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬，表現(xiàn)為流產(chǎn)、木乃伊胎、產(chǎn)下不能正常發(fā)育的弱仔。在妊娠最后的三個(gè)月里，如果易感的懷孕母豬感染了藍(lán)耳病毒將特別容易導(dǎo)致這些生殖癥狀。藍(lán)耳病毒污染的精液可以將該病傳染給母豬。
豬繁殖與呼吸綜合征于l987年首次在美國(guó)報(bào)導(dǎo)，不久以后歐洲也出現(xiàn)該病。血清學(xué)調(diào)查表明加拿大的豬只在20世紀(jì)70年代感染此病(Rossow，1998)，在歐洲Wensvoort等首次分離到這種病毒(1991)，在美國(guó)由Collins等分離到(1992 0有意思的是美洲和歐洲分離株存在基因組和抗原性的差異。當(dāng)進(jìn)行氨基酸比對(duì)時(shí)，兩個(gè)毒株病毒表面的主要糖蛋白的差異達(dá)到40％。所以將這種病毒分類(lèi)為1型(歐洲型)和2型(美洲型)。為什么一個(gè)全新的病毒在兩個(gè)大陸沿著不同的譜系進(jìn)化?為什么它們又幾乎在同一時(shí)間發(fā)病?這些問(wèn)題都有待解決。Hanada等(2005)提出，這種病毒大概在上世紀(jì)80年代從其他物種感染到了豬體，而且直到現(xiàn)在這種病毒還在改變著它糖蛋白上的跨膜區(qū)以適應(yīng)豬體。有報(bào)道稱(chēng)PRRSV在所有檢測(cè)過(guò)的RNA病毒當(dāng)中進(jìn)化速度是最快的。在其他的動(dòng)脈炎病毒中，鼠的乳酸脫氫酶增高癥病毒和藍(lán)耳病毒存在較近的親緣關(guān)系。
這種病毒高突變率的原因就是在這兩種類(lèi)型的PRRSV存在巨大的基因和抗原性差異。Stadejek等(2002)報(bào)道了東歐的l型PRRSV毒株和其他的l型PRRSV之間的差別。根據(jù)早期的田間分離株研發(fā)的PRRSV疫苗初期證明很有效，但是野毒株的基因差異降低了疫苗效果?；钜呙缈梢詼p少野毒株造成的病毒血癥，盡管還是可以從扁桃體分離出PRRSV。滅火苗似乎效果有限，即使被用來(lái)抵抗同源毒株的攻毒實(shí)驗(yàn)也效果欠佳(Zuckermann et al．，2007)。1型PRRSV疫苗不保護(hù)2型野毒的攻擊(van Woensel et al．，l998 0疫苗株和野毒株的同時(shí)感染也是可能的。
替米考星可能有抗藍(lán)耳病病毒的效果(Molitoret al．，2001，Benfield et al．，2002)。愛(ài)樂(lè)新是一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的抗生素，學(xué)名叫萬(wàn)樂(lè)霉素。以前發(fā)表的文獻(xiàn)(Stuart et al．，2007)表明萬(wàn)樂(lè)霉素進(jìn)入細(xì)胞并在胞內(nèi)蓄積的速度比替米考星更快。泰樂(lè)菌素是另一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)，它的胞內(nèi)蓄積效果很差。本實(shí)驗(yàn)的目的就是研究這三種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素在體外抗PRRSV的效果。
1材料與方法
1．1細(xì)胞系
由英國(guó)的吉米·格雷博士贈(zèng)送的MAl04細(xì)胞。在格拉斯哥培養(yǎng)基里添加10％的胎牛血清，100單位的青霉素(Invitrogen公司)和l00μg／mL的鏈霉素(Invitrogen公司)。
1．2藍(lán)耳病病毒株
歐洲株(1型)，DV株(英特威公司)為市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的疫苗株。將此毒株在MAl04細(xì)胞上進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。存貯培養(yǎng)的病毒滴度為l08空斑形成單位／毫升。美洲型(2型)毒株，VR2332(Benfield et al．，1992)，來(lái)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(kù)(ATCC。35℃下在MAl04細(xì)胞上擴(kuò)繁病毒(按照菌種庫(kù)的要求)存儲(chǔ)培養(yǎng)物的滴度為5×107空斑形成單位／mL。
1.3大環(huán)內(nèi)酯抗生素
由伊科動(dòng)物保健公司提供的口服用愛(ài)樂(lè)新溶液。該商品含有抗生素萬(wàn)樂(lè)霉素。替米考星預(yù)混劑Pulmotil(含有250m9／mL的鹽酸替米考星)和Tylan(含l9／g泰樂(lè)菌素)均購(gòu)買(mǎi)自Elanc0動(dòng)物保健公司。
1.4測(cè)定三種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的抗藍(lán)耳病效果

將105MAl04細(xì)胞在24孔板上培養(yǎng)。將24孔板在37℃下過(guò)夜培養(yǎng)。37℃下用不同濃度的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素處理4h時(shí)。在抗生素孵育的細(xì)胞里，用10空斑形成單位每個(gè)細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)分別感染1型和2型藍(lán)耳病毒。細(xì)胞在適合的溫度下培養(yǎng)20h，然后用4％(體積比)的甲醛／鹽酸鹽緩沖液固定。用間接免疫熒光來(lái)測(cè)定感染情況。
1．5免疫熒光
在室溫下用0．2％的Triton X—I00／PBS處理細(xì)胞5min以增加其滲透性。用單克隆抗體檢測(cè)l型藍(lán)耳病毒的核衣殼蛋白，單克隆抗體由瓦格寧根大學(xué)的Michael Kroese博士惠贈(zèng)。2型藍(lán)耳病毒用單克隆抗體2D6來(lái)檢測(cè)病毒的核衣殼蛋白。抗體分別按1／10和1／500的比例溶解在0．2％胎牛血清的PBS中，在室溫放置30min。將樣品用PBS—NCS洗滌兩次。第二抗體是羊抗鼠IgG，將其偶聯(lián)到Alexa Flu—or 488(Invitrogen公司)，在室溫條件下以l／1000的比例加入到PBS—NCS中，孵育30min。將樣品用PBS—NCS洗滌2次。用含有DAPI(4，6一二脒基一2一苯基吲哚鹽酸鹽)的封固劑(Invitrogen公司)將培養(yǎng)板的蓋子封閉在載板上，然后用共聚焦顯微鏡觀察。所有的細(xì)胞都用DAPl染色，藍(lán)耳病毒陽(yáng)性的細(xì)胞用熒光染色。
1．6吖啶橙細(xì)胞染色
將105MAl04細(xì)胞接種培養(yǎng)到24孔板內(nèi)。將24孔板在37。C下過(guò)夜。在不同的濃度下用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素處理細(xì)胞4h，或者不做處理。加水配制成2mol／L的吖啶橙儲(chǔ)備樣品(Invitrogen公司)并加到組織培養(yǎng)基內(nèi)，達(dá)到最終濃度為20μmol／L。將細(xì)胞在室溫下孵育lh，然后用PBS洗兩次。移除培養(yǎng)板蓋子后立刻放在載玻片上。用共聚焦顯微鏡來(lái)進(jìn)行觀察。在酸性的細(xì)胞區(qū)域(次級(jí)內(nèi)體和溶酶體)不見(jiàn)綠色熒光，他們呈現(xiàn)紅色熒光，對(duì)20個(gè)細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，把它們的平均數(shù)量排列成圖表。
2結(jié)果與分析
2．1大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的抗病毒效果
愛(ài)樂(lè)新和替米考星對(duì)1型藍(lán)耳病毒感染的抑制效果。用愛(ài)樂(lè)新處理過(guò)的MAl04細(xì)胞減少了PRRSV抗原的表達(dá)。每次處理后，表達(dá)PRRSV抗原的細(xì)胞數(shù)僅僅是細(xì)胞總數(shù)的一部分。當(dāng)使用愛(ài)樂(lè)新的濃度為0．1μg／mL的時(shí)候，l型藍(lán)耳病的復(fù)制降低了將近50％。替米考星也有抗病毒作用，雖然在濃度為0．1μg／mL的時(shí)候并沒(méi)有抑制效果，但是當(dāng)濃度為lμg／mL的時(shí)候PRRSV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少到了50％。當(dāng)替米考星濃度為l0μg／mL細(xì)胞有毒性作用。泰樂(lè)菌素沒(méi)有抗病毒作用，即使在濃度達(dá)到100μg／mL的時(shí)候也沒(méi)有效果。
用愛(ài)樂(lè)新和替米考星將MAl04細(xì)胞在特定的濃度下處理4h，然后用l型PRRSV(DV株)感染，感染復(fù)數(shù)為10~20h后固定細(xì)胞，用間接免疫熒光檢測(cè)病毒感染的細(xì)胞，綠色熒光為病毒的核衣殼蛋白，紅色熒光為α一微管蛋白。
按前文的方法將MAl04細(xì)胞用抗生素處理并進(jìn)行病毒感染。20h后固定細(xì)胞，用間接通過(guò)免疫熒光的方法來(lái)檢測(cè)病毒核衣殼蛋白，以此來(lái)檢測(cè)病毒感染的細(xì)胞。用DAPI(4，6一二脒基一2一苯基吲哚鹽酸鹽)將細(xì)胞核染色后計(jì)數(shù)，從而算出細(xì)胞感染率的百分比。
用2型PRRSV(美洲株)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)也得到了相同的結(jié)果，在使用0．1μg／mL愛(ài)樂(lè)新的時(shí)候，可以將PRRSV陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量減少到約50％，愛(ài)樂(lè)新濃度為l0μg／mL的時(shí)候，PRRSV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降到了2％以下。替米考星濃度為lμg／mL的時(shí)候可以把PRRSV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降到約50％，泰樂(lè)菌素在濃度為lμg／mL的時(shí)候沒(méi)有抑制藍(lán)耳病病毒復(fù)制的功能。
MAl04細(xì)胞用抗生素處理，然后感染2型藍(lán)耳病毒(VR一2332株)。20h后固定細(xì)胞，用間接免疫熒光的方法來(lái)檢測(cè)病毒感染的細(xì)胞，DAPl細(xì)胞核染色后計(jì)算感染細(xì)胞的百分比。
2．2大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)對(duì)內(nèi)體pH值的影響
為了檢測(cè)愛(ài)樂(lè)新抗病毒效果的機(jī)制，本文作者研究了愛(ài)樂(lè)新和其他大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物是否對(duì)內(nèi)體的pH值有影響。使用吖啶橙作為酸性細(xì)胞器的指示劑。

MAl04細(xì)胞中吖啶橙染色的次級(jí)內(nèi)體／溶酶體的平均數(shù)如圖4所示。使用泰樂(lè)菌素時(shí)，濃度達(dá)到100μg／mL的時(shí)候也不會(huì)減少經(jīng)吖啶橙染色的次級(jí)內(nèi)體數(shù)，但是在培養(yǎng)基中替米考星的濃度為1．0μg／mL的時(shí)候可以觀察到吖啶橙染色的次級(jí)內(nèi)體數(shù)有略微的減少。0．1μg／mL濃度的愛(ài)樂(lè)新少量的減少了酸|生內(nèi)體的數(shù)量，單個(gè)細(xì)胞中，呈紅色的次級(jí)內(nèi)體／溶酶體的數(shù)量從73減少到了68。當(dāng)愛(ài)樂(lè)新在培養(yǎng)基中的濃度為l．0μg／mL時(shí)就大大的減少了酸性?xún)?nèi)體的數(shù)量，每個(gè)細(xì)胞中酸性?xún)?nèi)體的數(shù)量?jī)H為10。
用愛(ài)樂(lè)新、泰樂(lè)菌素、替米考星處理MAl04細(xì)胞，在特定的濃度下處理4h。然后用2μmol／L的吖啶橙處理lmin。將細(xì)胞樣品用PBS洗下來(lái)放到載玻片上，然后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。吖啶橙染色的細(xì)胞呈綠色熒光，而酸性的細(xì)胞器如次級(jí)內(nèi)體／溶酶體呈紅色熒光。按前文提到的方法用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)處理MAl04細(xì)胞，然后進(jìn)行吖啶橙染色。對(duì)每個(gè)細(xì)胞中的紅色熒光細(xì)胞器進(jìn)行計(jì)數(shù)，算出在每組抗生素特定濃度下的平均值。

xxc1963

謝謝您寶貴的試驗(yàn)資料。請(qǐng)問(wèn)泰樂(lè)菌素殺毒道理何在？？