豬病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷技術(shù)之 十二、豬細(xì)小病毒檢測方法

nnii521

十二、豬細(xì)小病毒檢測方法

豬細(xì)小病毒血凝抑制試驗(yàn)操作方法
    （一）材料準(zhǔn)備
1．抗原：豬細(xì)小病毒濃縮抗原
2．PPV陽性及陰性血清
3．被檢血清：自被檢豬的前腔靜脈血或自耳靜脈采血分離血清。

4．紅細(xì)胞：按抗凝劑與血液1：4的比例心臟采集豚鼠血液，用PBS洗三次，沉積紅細(xì)胞配成0.5%懸液備。

5．稀釋液：用滅菌的PH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）。

6．25%白陶土：取白陶土25克，置離心瓶中，加入適量1mol/L鹽酸溶液，充分?jǐn)噭颍?/font>2 000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，再加1mol/L鹽酸溶液，攪勻，離心，反復(fù)洗三次，沉淀白陶土，用0.15mol/L生理鹽水100毫升配成25%懸液，然后用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH7.2左右,高壓滅菌,置4℃備用,保存期不超過半年。

7．器材：96孔U型滴定板或V型滴定板，25微升稀釋棒，25微升滴管，微量振蕩器，普通離心機(jī)。
（一）
試驗(yàn)操作

HA：用滴管在滴定板上從第一孔至試驗(yàn)所需稀釋倍數(shù)孔，每孔滴加稀釋液25微升于第一孔再滴加抗原25微升，用稀釋棒從第一孔開始依次稀釋。置微量振蕩器上振蕩15秒，最后每孔滴加0.5%豚鼠紅細(xì)胞25微升，振蕩30分鐘，置室1小時(shí)判定并記錄結(jié)果。

HI：用滴管在滴定板上從第一孔至所需稀釋倍數(shù)孔各加稀釋液25微升，于第一孔滴加被檢測血清25微升，然后每孔加4單位抗原25微升，振蕩15秒，置4℃13小時(shí)或室溫4小時(shí)，每孔加0.5%的豚鼠紅細(xì)胞懸液25微升，振蕩30秒，置室溫1小時(shí)判定結(jié)果。以完全抑制的最高稀釋倍數(shù)做為HI價(jià)。同時(shí)設(shè)已知陽性血清、已知陰性血清、不加抗原的被檢血清及抗原、紅細(xì)胞對(duì)照?？乖瓕?duì)照亦即第二滴定，復(fù)核使用單位。
（二）
判定標(biāo)準(zhǔn)及注意事項(xiàng)
1．
判定時(shí)先檢查對(duì)照是否正確，唯有對(duì)照各孔準(zhǔn)確方可證明操作和使用材料無誤。
2．
紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的判定
    （1）紅細(xì)胞均勻的平均鋪于孔底者可判為“++++”。
    （2）基本上與（1）相同，但邊緣有下滑皺縮者為“+++”。
    （3）紅細(xì)胞于孔底形成環(huán)狀或成團(tuán)，四周有小凝集塊者為“++”。
    （4）紅細(xì)胞于孔底形成團(tuán)塊，但邊緣不整齊或有少量小塊者為“+”。
    （5）紅細(xì)胞于孔底形成小團(tuán)塊，邊緣整齊光滑，稀釋液清亮者為“—”。
“++”以上凝集的最高稀釋倍數(shù)做為HA價(jià)。

3．凝集抑制：本試驗(yàn)紅細(xì)胞集中于孔底呈團(tuán)塊狀，邊緣光滑整齊為陽性，以“—”表示，說明抗原凝集紅細(xì)胞的特性已被抑制，反之紅細(xì)胞呈“++”以上凝集現(xiàn)象者判為陰性。
1．凝集抑制價(jià)：以被檢血清最大稀釋倍數(shù)能抑制紅細(xì)胞凝集者為該血清抑制價(jià)。

(吳
斌)

豬細(xì)小病毒病乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）操作方法

豬細(xì)小病毒乳膠凝集試驗(yàn)是用豬細(xì)小病毒培養(yǎng)液致敏乳膠抗原來檢測動(dòng)物血清中的抗體。其具有簡便、快速、特異、敏感之優(yōu)點(diǎn)。
（一）
試驗(yàn)材料
豬細(xì)小病毒病乳膠凝集試驗(yàn)抗體檢測試劑盒：包括豬細(xì)小病毒致敏乳膠抗原、陽性血清、陰性血清和稀釋液、玻片、吸頭及使用說明書。由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院研制。
（二）
操作方法

1．定性試驗(yàn)：取檢測樣品（血清）、陽性血清、陰性血清、稀釋液各一滴，分置于玻片上，各加乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動(dòng)1~2分鐘，于3~5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。

2．定量試驗(yàn)：先將血清作連續(xù)稀釋，各取1滴依次滴加于乳膠凝集反應(yīng)板上，另設(shè)對(duì)照同上，隨后再各加乳膠抗原一滴，如上攪拌并搖動(dòng)，判定。
   （三）結(jié)果判定


1．判定標(biāo)準(zhǔn)：

“++++”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明；

“+++”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；

“++”約50％乳膠凝集，但顆粒較細(xì)，液體較混濁；

“+”有少許凝集，液體呈混濁：

“—”液滴呈原有的均勻乳狀。

2．對(duì)照試驗(yàn)出現(xiàn)如下結(jié)果試驗(yàn)方可成立，否則應(yīng)重試：陽性血清加抗原呈“++++”；陰性血清加抗原呈“—” ；抗原加稀釋液呈“—”。
以出現(xiàn)“++”以上凝集者判為陽性凝集。
   （四）注意事項(xiàng)

1．試劑在2~8℃冷暗處保存，暫定1年。

2．乳膠抗原在使用前應(yīng)輕輕搖勻。

(吳
斌)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測豬細(xì)小病毒

1 材料準(zhǔn)備:待檢組織、組織勻漿器、蛋白酶K，十二烷基磺酸鈉（SDS），苯酚、氯仿，異戊醇（分析純）、TEN緩沖液。

引物：擴(kuò)增豬細(xì)小病毒VP2基因中445bp基因片段，由上海生物工程公司合成。

序列為,
上游引物P1:
5’-CAGAATCAGCAACCTCAC-3’

  下游引物P2:
5’-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG-3’

  儀器設(shè)備有：凝膠電泳紫外線檢測儀， PCR擴(kuò)增儀，電泳儀
2操作步驟：
2.1 樣品的采集：采集病豬的淋巴結(jié)、肝臟置-20℃保存。
2.2 樣品處理  所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管內(nèi)，-70℃反復(fù)凍融3次，7000r/min離心5min。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴搖床上放置2h后加入等量的飽和酚500μl，渦旋20s。離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：異戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl雙蒸水溶解，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/font>
2.3.
PCR的操作程序
PCR反應(yīng)體系為：總體積50μl，含有100μmol/L dNTPs，5μmol/L引物， 0.5U Taq酶及1μl模板DNA，常用的反應(yīng)體系組成如下：

10×緩沖液
5.0 μl

25mM MgCl2
5.0 μl

dNTPs
1.0 μl

引物
各1.0μl

Taq聚合酶
0.5μl

DNA模板
1.0μl

滅菌去離子水
35.50μl

擴(kuò)増條件為:94℃變性3分鐘，進(jìn)入循環(huán)，94℃45秒，54℃45秒，72℃30秒，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。
2.4
PCR產(chǎn)物的檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，在紫外光下觀察結(jié)果，并與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較，可見一條445bp的DNA片段。

hanhong

沙發(fā)都被我坐了，資料也收藏了哈！

dwm8080

基礎(chǔ)知識(shí)好，打包壓縮更方便

姜寧

你可以操作嗎，到時(shí)找你檢測，如何？