豬病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷技術(shù)之 十五、豬傳染性胸膜肺炎間接血凝試驗(yàn)（IHA）操作方法

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十五、豬傳染性胸膜肺炎間接血凝試驗(yàn)（IHA）操作方法

本方法系用豬傳染性胸膜肺炎嗜血桿菌多血清型抗原致敏戊二醛—鞣酸化處理的綿羊紅細(xì)胞作為抗原，供作間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)豬傳染性胸膜肺炎抗體之用。

（一）試驗(yàn)材料

1. 96孔V型醫(yī)用血凝板

2. 稀釋液：含1%健兔血清（56℃30分鐘滅活）的pH7.2 0.15M PBS液。

3. 診斷液為1%致敏血球抗原。

（二）操作步驟

1．滴加稀釋液：用微量移液器每孔加0.025毫升稀釋液。

2．血清稀釋?zhuān)菏褂梦⒘肯♂尠粽喝”粰z豬血清，置于第1孔中，作倍比稀釋至7孔，8孔為空白對(duì)照，各孔稀釋度分別為1：2、1：4、1：8、1：16、：1：32、1：64、1：128。

3．滴加致敏紅細(xì)胞：給被檢測(cè)血清各稀釋孔滴加嗜血桿菌致敏的綿羊紅細(xì)胞懸液25微升。置于微型振蕩器上振蕩1~2分鐘，置37℃溫箱作用2小時(shí)后判定結(jié)果。

4．設(shè)對(duì)照：在同一V型板上設(shè)嗜血桿菌陽(yáng)性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照和稀釋液對(duì)照。在所有對(duì)照成立時(shí)，方可判定結(jié)果。

（三）結(jié)果判定

被檢測(cè)豬血清血凝效價(jià)大于或等于1：8（++）以上者，判為陽(yáng)性（暫定）。血凝價(jià)小于1：4（++）者為陰性。

附：玻片沉淀試驗(yàn)

該方法采用環(huán)狀沉淀試驗(yàn)的胸膜肺炎嗜血桿菌可溶性耐熱抗原和玻片凝集試驗(yàn)所用抗血清進(jìn)行快速玻片試驗(yàn)。

用途：各血清型的定型

操作方法：將用于環(huán)狀沉淀試驗(yàn)的一滴抗原與玻片上一滴血清混合，搖動(dòng)，1~3分鐘后判定結(jié)果。

   結(jié)果判定：如發(fā)生肉眼可見(jiàn)的絮狀凝集者為陽(yáng)性，不凝集者為陰性。

(逯忠新)

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌病聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
1 材料準(zhǔn)備：待檢組織、培養(yǎng)基
       引物：預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為610bp，由上海生物工程公司合成。


序列為，上游引物P1： 5’_CCGACTTTTAAATCCGT-3’
               下游引物P2:
5’_GAACAGTTGTTCCGCTAA-3’
儀器設(shè)備有：凝膠電泳紫外線檢測(cè)儀，PCR擴(kuò)增儀，電泳儀，CO2培養(yǎng)箱
2操作步驟：
2．1
培養(yǎng)基的制備：PPLO巧克力培養(yǎng)基的制備。取35克PPLO瓊脂加熱溶于1000ml水中，121℃ 滅菌30min，冷卻到60℃左右加10%（v/v）脫纖綿羊脂和1%的葡萄糖（w/v）于80℃水浴，培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)榍煽肆ι蛊矫螅?/font>4℃保存。
2．2
樣品的采集：取病豬的肺組織，低溫保純。
2． 3 樣品的處理：采病豬的肺組織無(wú)菌接種于PPLO培養(yǎng)基，37℃，10% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-36h后，將菌落透明，圓潤(rùn)，直徑1-2mm的菌株用刮取2個(gè)菌落洗脫于含100ml無(wú)菌水的離心管中，1000r/m離心5min，棄上清，用無(wú)菌水懸浮，渦旋后，于沸水中水浴10 min后，再放置-20℃凍結(jié)。凍融后10000r/min離心5min,取上清作模板。
2．4
PCR操作程序

PCR反應(yīng)體系：  總體積50µl ,5µl 10倍緩沖液，3µl 25 m mol/L Mgcl2, 1µl
2 m mol/L dNTPs,5µmol/L上游引物，下游引物各3µl,Taq 0.5µl,模板7µl，無(wú)菌
水27.5µl.

PCR.反應(yīng)條件：于94℃變性3min后，進(jìn)入循環(huán)94℃ 1 min,50℃ 1min30s,

72℃ 1min40s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物于4℃保存.
2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：取8µl.擴(kuò)增產(chǎn)物和5µl DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，加到含EB的0.8%瓊脂凝膠中，電壓為80V，電流為40-60mA，電泳15min左右，然后在紫外燈下觀察。

豬2型圓環(huán)病毒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1 材料準(zhǔn)備:待檢組織、組織勻漿器、蛋白酶K，十二烷基磺酸鈉（SDS），苯酚、氯仿，異戊醇（分析純）、TEN緩沖液。溶液配制見(jiàn)附錄C(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)

引物：擴(kuò)增偽狂犬病病毒基因中1093-1586bp之間494bp基因片段，由上海生物工程公司合成。

序列為,
上游引物P1:
5’-CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT-3’

   下游引物P2:
5’-GAC AGT ATA TCC GAA GGT GCG G-3’

  儀器設(shè)備有：凝膠電泳紫外線檢測(cè)儀， PCR擴(kuò)增儀，電泳儀
2操作步驟：
2.1 樣品的采集：采集病豬的淋巴結(jié)、肺臟置-20℃
2.2 樣品處理  所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管內(nèi)，-70℃反復(fù)凍融3次，7000r/min離心5min。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴搖床上放置2h后加入等量的飽和酚500μl，渦旋20s。離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：異戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl雙蒸水溶解，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/font>
2.3.
PCR的操作程序PCR反應(yīng)體系為：總體積50μl，含有50m mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.1％Triton X-100，100μmol/L dNTPs，5μmol/L引物，2 m mol/L MgCl2，及0.5U Taq酶，1μl模板DNA。
常用的反應(yīng)體系組成如下

10×緩沖液
5.0μl

15mM MgCl2
3.0 μl

dNTPs
1.0 μl

引物
各2.5μl

Taq聚合酶
0.5μl

DNA模板
1.0μl

滅菌去離子水
34.5μl

擴(kuò)増條件為:94℃變性3分鐘，進(jìn)入循環(huán)，94℃60秒，55℃60秒，72℃90秒，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘。
2.4
PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，在紫外光下觀察結(jié)果,可見(jiàn)一494bp的特異性片段。

hanhong

樓主你肯定是高手，向你學(xué)習(xí)！

dwm8080

基礎(chǔ)知識(shí)好，打包壓縮更方便

姜寧

你可以操作嗎，到時(shí)找你檢測(cè)，如何？