投喂益生菌對(duì)黃河鯉魚免疫效果的研究

胡文輝

殷海成 趙紅月

摘要：本試驗(yàn)研究蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）對(duì)黃河鯉魚血液免疫應(yīng)答強(qiáng)度的影響。將蘇云金芽胞桿菌按1.0×1011、3.0×1011、5.0×1011 cfu/kg三個(gè)濃度添加在魚用全價(jià)顆粒飼料中，投喂經(jīng)嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）疫苗免疫(A0～3)和未免疫組(B0～3)黃河鯉魚，分別于0，15，30，40d時(shí)檢測(cè)各組鯉魚白細(xì)胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、血清凝集抗體效價(jià)，并進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果表明：添加蘇云金芽胞桿菌均能顯著提高黃河鯉的白細(xì)胞吞噬活性和溶菌酶活性，增強(qiáng)黃河鯉的凝集抗體效價(jià)；各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組免疫應(yīng)答強(qiáng)度差異顯著（P<0.05），免疫組免疫應(yīng)答強(qiáng)度明顯高于未免疫組，且差異顯著（P<0.05）；蘇云金芽胞桿菌能提高黃河鯉經(jīng)活菌攻毒后的存活率，其中，當(dāng)菌株添加濃度為5.0×1011cfu/kg時(shí)，受免疫的鯉免疫保護(hù)率（Relative percent survival）最高。即投喂蘇云金芽胞桿菌對(duì)黃河鯉魚血液免疫應(yīng)答有明顯促進(jìn)作用。
關(guān)鍵詞：益生菌；黃河鯉魚；免疫
Effects of Feeding on Probiotics on the Immune Response of Cyprinus carpio in Yellow River

YIN Hai-Cheng
ZHAO Hong-Yue

Henan University of Technology,Zheng zhou 450001, China

Abstract:

To study the effect of Bacillus thuringiensis（Bt）on the immune response of Cyprinus carpio in Yellow River, the concentrations of Bacillus in test groups feed were respectively 1.0×1011, 3.0×1011, 5.0×1011cfu/kg for the fish were immunized with A.hydrophilain group (A0～3) and the fish weren’t immunized in group (B0～3), Phagocytic activity of leucocytes, lysozyme activity, agglutinating antibody titer and by challenging with live A·hydrophila were checked for 0，15,30,40days. The results showed: Feed contain different concentrations Bacillus thuringiensis all could reprove the phagocytic activity of leukocytes, lysozyme activity and reprove agglutinating antibody titer. Difference is notable between adding and contrasting groups, were immunized and weren’t immunized (P <0.05). Bacillus could reprove the survival rate of cyprinus carpio in Yellow River after challenged with live A.hydrophila. When he concerntration of Bacillus is 5.0×1011cfu/kg feed, the RPS of immunized cyprinus carpio in Yellow River is the highest.

基金項(xiàng)目：河南工業(yè)大學(xué)?；?/font> (06XJC024)

Namely feeding with the Bacillus thuringiensis having promoting an effect obviously to cyprinus carpio in Yellow River blood immunity response.

Keywords: Probiotics; Cyprinus carpio in Yellow River; Immunity

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)屬于革蘭氏陽性菌，廣泛應(yīng)用于防范作物、森林、果蔬蟲害，如殺滅寄生線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、日本血吸蟲等，在生物防治中占有極其重要的地位（李今煜等，2008）。隨著對(duì)Bt結(jié)構(gòu)功能、遺傳、工程菌構(gòu)建、以及全基因組序列等深入研究，使Bt的應(yīng)用前景更加廣闊。對(duì)于魚類的免疫研究，主要體現(xiàn)在應(yīng)用中草藥、免疫多糖、肽類、益生菌制劑以及免疫增強(qiáng)劑等。如李清等（2005）應(yīng)用小肽探討鯉魚的免疫應(yīng)答，添加1%的劑量取得較好的免疫效果；Kozinska A,Guz L（2004）用脂多糖注射鯉魚，可提高其免疫力。然能否將Bt作為微生態(tài)制劑，應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，目前沒有報(bào)道，故值得研究。本試驗(yàn)應(yīng)用全價(jià)飼料添加不同劑量的Bt，研究Bt對(duì)黃河鯉魚免疫應(yīng)答反應(yīng)的效果，探討Bt在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 黃河鯉魚分組與免疫處理

選擇400尾體重75±0.52 g的健康黃河鯉，隨機(jī)均分8組，每組50尾，編號(hào)分別為：A0（對(duì)照組）、A1、A2、A3（含A四組在7 d和14 d分別注射A．hydrophila菌苗免疫0.2 mL/尾（1×108 cells/mL）和B0（對(duì)照組）、B1、B2、B3（含B四組未免疫），養(yǎng)于直徑2 m的專用箱馴養(yǎng)15 d，開始試驗(yàn)。

免疫結(jié)束后，開始試驗(yàn)。試驗(yàn)期間投喂飼料成分相同，試驗(yàn)組飼料中分別添加蘇云金芽胞桿菌1.0×1011、3.0×1011、5.0×1011 cfu/kg，對(duì)照組不添加。每日喂食兩次（8:00，17:00），連續(xù)30 d。之后改投相同的不含芽孢桿菌飼料。日投餌量為試驗(yàn)魚體重的2.50%-4.50 %。整個(gè)試驗(yàn)期間，保持微流水，24 h充氣。

1.2 飼料選擇及加工

飼料選用河南大德飼料科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)的鯉魚全價(jià)配合顆粒飼料（101＃，粗蛋白34%、粗脂肪5.0%、粗纖維8.0%），粉碎后加入需要量蘇云金芽胞桿菌，充分拌勻，用小型制粒機(jī)（曲阜市應(yīng)用科技研究所，93KWP-105）加工成直徑為1.5 mm的顆粒，于38 ℃下烘干，保存?zhèn)溆谩?/font>

1.3 抗原

將嗜水氣單胞菌（A．hydrophila）接種于FWA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)36 h，集菌。然后加入終濃度為0.5%的福爾馬林，28℃滅活24 h，即為福爾馬林滅活的A．hydrophila菌苗，以0.65%的滅菌生理鹽水將滅活的A．hydrophila菌苗濃度調(diào)整為1×108cells/mL作為抗原。置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/font>

1.4 采血及處理

試驗(yàn)的第0d、15d、30d、40d（停喂后的第10d）上午進(jìn)行血樣采集，采用心臟和斷尾采血兩種方法。每組取10尾。取血后，將每尾魚的血液樣本分成2份，1份置室溫1h，再置冰箱內(nèi)4h，以2000r/min離心15min分離血清，供檢測(cè)溶菌酶活性；另一份以肝素抗凝，供測(cè)定白細(xì)胞吞噬活性。

1.5 白細(xì)胞吞噬活性測(cè)定

將金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）接種在FWA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)36h，集菌，并用無菌生理鹽水離心洗滌2次，制成金葡菌懸液。取金葡菌懸液，加入終濃度為0.5%的福爾馬林，28℃滅活24 h，作為本試驗(yàn)中的吞噬原。在0.25mL抗凝血中加入0.1mL用滅菌生理鹽水調(diào)整為1×108cells/mL的金葡球菌懸液，搖勻后置于28℃恒溫水浴鍋中，孵育1 h，每個(gè)血樣做血涂片5張，自然晾干，甲醇固定，Giemsa染色，油鏡觀察并計(jì)數(shù)。計(jì)算：吞噬百分比（PP）=（100個(gè)白細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100）×100；吞噬指數(shù)（PI）=被吞噬的細(xì)菌數(shù)/吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)。

1.6 血清溶菌酶活性測(cè)定

1.6.1菌液的制備

以粉狀溶壁微球菌（micrococcus lysoleikticus）配成4×106 cfu/mL菌液，再用722型分光光度計(jì)于640 nm測(cè)定并調(diào)整其濃度，使OD640=0.3。

1.6.2溶菌酶活性的測(cè)定

取0.1 mL血清2份，一份于28 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min后加入1.8 mL菌液，2 min時(shí)加入2滴5 mol/L KOH溶液終止反應(yīng)，測(cè)640 nm波長(zhǎng)下透光率為T1％。另一份重復(fù)上述步驟，測(cè)透光率為T0％。T1％－T0％即溶菌酶所致透光率的變化。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，查血清中溶菌酶活性。

1.7 凝集抗體效價(jià)測(cè)定

采用血凝板依常法進(jìn)行。反應(yīng)抗原采用F-AH。
1.8攻毒試驗(yàn)

于免疫后第40d采用A．hydrophila（1×108cells/mL）對(duì)各組試驗(yàn)魚進(jìn)行攻毒。每組分別取供試魚20尾，經(jīng)胸鰭基部注射0.2mL A．hydrophila活菌懸液。飼養(yǎng)觀察14d，統(tǒng)計(jì)各組的死亡率，依下式計(jì)算免疫保護(hù)率（relative percent survival, RPS）。

免疫保護(hù)率（RPS）=[1－（免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率）]×100%

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用STATISTIC6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異用Dunca，s多重比較，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 投喂芽孢桿菌對(duì)黃河鯉白細(xì)胞吞噬活性的影響

投喂蘇云金芽胞桿菌對(duì)受免和未免黃河鯉白細(xì)胞吞噬活性的影響見表1。

表1
投喂蘇云金芽胞桿菌對(duì)受免和未免黃河鯉白細(xì)胞吞噬活性的影響；*表示停止Bt后10d

Table1
Influence of the phagocytic activity of leukocytes of immunized Huanghe cyprinus carpio before and after feeding Bt.（Mean±SD）;* 10 d after feeding without Bt

天數(shù) Days	吞噬活性 Phogocytic activity	組別 （Groups）
		A0 A1 A2 A3 B0 B1 B2 B3
0	PP	32.91±3.08a 31.88±2.29a 32.30±2.51a 33.12±2.44a 32.45±3.14a 31.72±1.86a 32.21±2.25a 33.41±2.51a
	PI	1.16±0.19a 1.41±0.11a 1.34±0.07a 1.36±0.19a 1.15±0.07a 1.32±0.31a 1.08±0.14a 1.12±0.30a
15	PP	38.81±3.06b 60.81±2.54c 64.67±5.12c 63.15±4.23c 32.15±3.37a 55.03±2.05c 58.48±1.58c 58.83±3.21c
	PI	1.26±0.16b 3.45±0.22c 2.60±0.11c 3.27±0.32c 1.22±0.41a 2.18±0.81c 2.35±0.15c 3.01±0.26c
30	PP	38.24±2.09b 58.67±2.15c 62.52±1.23c 60.23±4.14c 34.80±3.04a 57.28±1.05c 59.12±1.82c 58.67±3.08c
	PI	1.47±0.16b 3.02±0.11c 2.46±018c 2.45±0.25c 1.28±0.14a 3.36±0.24c 3.51±0.33c 3.74±0.24c
40*	PP	39.80±3.01b 59.62±3.44c 60.45±1.83c 61.45±2.20c 34.24±2.18a 51.48±1.42c 53.80±3.44c 52.35±3.19c
	PI	1.58±0.11b 3.96±0.34c 4.15±0.30c 4.28±0.21c 1.33±0.23a 3.44±0.23c 3.72±0.11c 3.57±0.48c

由表1可以看出，各試驗(yàn)組在投喂芽孢桿菌前，PP、PI均無顯著性差異。投喂芽孢桿菌后第15 d，免疫組A1、A2、A3組的吞噬活性達(dá)到最強(qiáng)，分別為60.81±2.54c、3.45±0.22c，64.67±5.12c、2.60±0.11c，63.15±4.23c、3.27±0.32c，對(duì)照A0組為38.81±3.06b、1.26±0.16b，15d后，A1、A2、A3組的PP和PI雖有不同程度的下降，但仍顯著高于A0組。Dunca，s多重比較A1、A2、A3組間PP和PI無顯著性差異（P>0.05），與A0組對(duì)比差異顯著（P<0.05），A0組在投喂前后則差異顯著（P<0.05）。試驗(yàn)對(duì)未受免組，芽孢桿菌也能提高黃河鯉白細(xì)胞的吞噬活性，表現(xiàn)和免疫組相似，但白細(xì)胞的PP和PI均低于免疫組（30d時(shí)最高）。說明投喂一定量蘇云金芽胞桿菌可提高受免黃河鯉的白細(xì)胞吞噬活性。

2.2 投喂芽孢桿菌對(duì)鯉血清溶菌酶活性的影響

投喂蘇云金芽胞桿菌對(duì)鯉魚血清溶菌酶活性的影響見表2。試驗(yàn)各組在投喂蘇云金芽胞桿菌前，溶菌酶活性并無顯著性差異（P>0.05）。投喂開始之后的第15d，免疫組A1、A2、A3各組的溶菌酶活性顯著增高，且達(dá)到最高值，分別為99.87±2.12c、106.10±1.21b、100.94±1.47a。而未經(jīng)免疫各組同樣增高，但增速小于免疫組。Dunca，s多重比較，A2組與A3組無顯著性差異（P>0.05），但于A1組間差異顯著（P<0.05），免疫組與未免疫組差異顯著（P<0.05）。30d之后到停止投喂，溶菌酶活性雖然稍有下降，但差異不顯著（P>0.05）。且仍顯著高于對(duì)照組（45.32 u/mL-52.80 u/mL）。由此可知：飼料中添加蘇云金芽胞桿菌可提高黃河鯉的血清溶菌酶活性，添加濃度越高效果相對(duì)越好（3.0×1011；5.0×1011
cfu/kg）。

表2
投喂蘇云金芽胞桿菌對(duì)受免和未免黃河鯉血清溶菌酶活性的影響（單位u/mL）

Table 2
Influence of the lysozyme activity in serum of immunized Huanghe cyprinus carpio before and after feeding Bt.（Mean±SD）;( u/mL)

天數(shù) Days	組別和溶菌酶活性（Groups and lysozyme activity）
	A0 A1 A2 A3 B0 B1 B2 B3
0	45.32±1.52a 45.42±2.02a 45.82±2.07a 45.24±3.70a 44.90±2.81a 45.04±2.51a 45.22±0.23a 45.70±1.08a
15	52.32±1.41a 99.87±2.12b 106.10±1.21c 100.94±1.47c 47.84±3.64 a 78.50±1.74d 86.12±1.60d 90.54±1.84d
30	52.80±2.42a 98.92±3.51b 100.40±2.04c 99.54±2.36c 47.78±4.01a 74.48±4.82d 85.34±5.65d 88.56±4.82d
40*	52.50±1.24a 95.84±2.34b 96.52±2.03c 95.93±2.10c 47.94±2.59a 68.51±3.30d 65.47±1.87d 66.30±3.81d

*表示停止投喂芽孢桿菌后10d ; * 10 d after feeding without Bt

2.3 投喂蘇云金芽胞桿菌對(duì)黃河鯉凝集抗體效價(jià)的影響

免疫組（A0、A1、A2、A3）的凝集抗體效價(jià)隨投喂天數(shù)逐漸上升，在30d時(shí)達(dá)到最高值。以A2組凝集抗體效價(jià)最高，達(dá)1:120.56，其次為A3為1:119.40，二者近似相等；A0組最低為1:101.32。投喂?jié)舛雀撸?/font>5.0×1011 cfu/kg），所獲得的凝集抗體效價(jià)也高。而未免疫組（B0、B1、B2、B3）的凝集抗體效價(jià)在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)處于1:＜4-8之間，明顯低于免疫組。說明投喂蘇云金芽胞桿菌能提高受免黃河鯉的凝集抗體效價(jià)（見表3）。

表3
投喂蘇云金芽胞桿菌后黃河鯉凝集抗體效價(jià)的變化

Table 3
Agglutination antibody titer of Huanghe cyprinus carpio before and after feeding Bt

組別group	天數(shù)和凝集抗體效價(jià) days and agglutination antibody titer
	0 15 30 40*
A0 1:＜4 1，(＜4)2 1:16-256(82.50) 1:64-256(101.32) 1:32-256(90.61)
A1 1:＜4，(＜4) 1:64-256(89.61) 1:64-256(111.09) 1:64-256(104.06)
A2 1:＜4，(＜4) 1:64-256(95.74) 1:128-512(120. 56) 1:64-256(111.02)
A3 1:＜4，(＜4) 1:64-256(98.01) 1:128-512(119.40) 1:64-256(106.75)
B0 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8 (4.01) 1:＜4--8(4.75) 1:＜4-8(4.20)
B1 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8 (4.90) 1:＜4-8(5.21) 1:＜4-8(4.38)
B2 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8(5.01) 1:＜4-8(5.32) 1:＜4-8(4.21)
B3 1:＜4，(＜4) 1:＜4-8(4.98) 1:＜4-8(5.17) 1:＜4-8(4.73)

*表示停止投喂芽孢桿菌后10d；1 表示凝集抗體效價(jià)的范圍；2 表示凝集抗體效價(jià)的幾何平均數(shù)

*10 d after feeding without Bt;1 indicate spectrum of agglutination antibody titer;2 indicate geometric mean of agglutination antibody titer

2.4 攻毒后的存活率

各組魚經(jīng)活菌攻毒后，死亡情況見表4。從表5可以看出，經(jīng)過免疫接種后的鯉魚均獲得了一定的免疫保護(hù)率，且蘇云金芽胞桿菌能提高受免鯉魚的存活率。當(dāng)蘇云金芽胞桿菌在飼料中的添加濃度為5.0×1011cfu/kg飼料時(shí)，受免鯉魚獲得了最高的免疫保護(hù)率（>70%）。而未免疫組攻毒試驗(yàn)結(jié)果，其死亡率大于60%。

表4 活菌攻毒后鯉的死亡率和免疫保護(hù)率

Table4 Mortality and relative percent survival of the experiment and control Cyprinus carpio after challenged with live A.hydrophila

組別 groups	攻毒魚尾數(shù) No. of fish challenged	死亡魚尾數(shù) No. of dead fish	死亡率 Mortality（％）	免疫保護(hù)率 RPS(%)
A0	20	15	75	16.67
B0	20	18	90
A1	20	11	55	31.25
B1	20	16	80
A2	20	5	25	61.54
B2	20	13	65
A5	20	3	15	75.00
B3	20	12	60

3 討論

3.1蘇云金芽胞桿菌對(duì)黃河鯉魚白細(xì)胞吞噬活性、溶菌酶活性的影響

近年來，微生態(tài)制劑在畜禽飼料中應(yīng)用較多，主要能提高其免疫應(yīng)答能力，但在水產(chǎn)動(dòng)物飼料以及預(yù)防疫病研究較少。在本試驗(yàn)應(yīng)用蘇云金芽胞桿菌投喂黃河鯉魚，觀察鯉魚的血液免疫應(yīng)答能力，效果明顯。
這與劉克林、何明清（2000）用益生菌對(duì)鯉魚免疫功能影響研究結(jié)果一致；同時(shí)證實(shí)蠟樣芽孢桿菌對(duì)肉雞血中L細(xì)胞值有明顯提高。溫俊、孫東巖（2008）應(yīng)用合生素對(duì)鯉魚抗病力研究，取得較好的保護(hù)率。陳昌福（1998）利用細(xì)菌脂多糖對(duì)鯉魚淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果也表明有明顯的激活作用，使淋巴細(xì)胞數(shù)量的增強(qiáng)。溶菌酶是動(dòng)物非特異性免疫物質(zhì)之一，在動(dòng)物防御機(jī)制中同樣起著重要作用。王宏田等（2000）、王雄等（2004）報(bào)道微生態(tài)制劑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶活性有增強(qiáng)作用。Marja和Antti（1992）研究表明，在一定程度上，血漿中的溶菌酶水平變化是與循環(huán)系統(tǒng)中的白細(xì)胞數(shù)目變化是一致的。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，添加蘇云金芽胞桿菌顯著提高鯉魚血液中細(xì)胞吞噬活性、溶菌酶活性以及免疫保護(hù)力。其中當(dāng)芽孢桿菌濃度為5.0×1011cfu/kg時(shí)效果最為明顯。

3.2 蘇云金芽胞桿菌對(duì)黃河鯉凝集抗體效價(jià)及免疫效果的影響

高等動(dòng)物通過檢測(cè)抗體和依據(jù)抗體滴度反映免疫應(yīng)答水平。Inooka和Kimura（1983）報(bào)道用納豆芽孢桿菌飼喂雛雞后，能夠增強(qiáng)雛雞對(duì)抗綿羊紅細(xì)胞的凝集抗體的產(chǎn)生；盧勝明（2002）報(bào)道益生芽孢桿菌制劑能顯著提高雛雞的新城疫血凝抑制效價(jià)，對(duì)雛雞具有免疫調(diào)節(jié)作用。但關(guān)于微生態(tài)制劑對(duì)魚類凝集抗體效價(jià)的作用的報(bào)道并不多見。楊先樂等（1990）研究草魚出血病發(fā)現(xiàn)免疫保護(hù)力較高時(shí)，血清中抗體水平也較高。從本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，受免疫鯉的血清凝集抗體效價(jià)隨著芽孢桿菌濃度的增加而升高。在4個(gè)免疫組中，第30d時(shí)，A2組凝集抗體效價(jià)最高，平均為1:120.56，其次是A3組，平均凝集抗體效價(jià)為1:119.40，這說明芽孢桿菌可以提高鯉的特異性免疫機(jī)能。但也有文獻(xiàn)報(bào)道免疫保護(hù)力與血清中抗體水平不一致的現(xiàn)象。Toranzo等（1995）用腸球菌的二價(jià)疫苗免疫鱒魚，血清凝集抗體效價(jià)非常低，但對(duì)攻毒表現(xiàn)了良好的免疫保護(hù)效果。這種現(xiàn)象被認(rèn)為可能是受免疫魚類對(duì)菌苗的免疫應(yīng)答中，所產(chǎn)生的特異性抗體不全是保護(hù)性抗體的緣故。

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其實(shí)益生菌在很多動(dòng)物上都做過試驗(yàn)，而且專家的數(shù)據(jù)還都不錯(cuò)，但是關(guān)鍵在于實(shí)際生產(chǎn)的效果啊