讓我們更進(jìn)一步了解小肽

sunmy888

本文簡要論述了微生物發(fā)酵法和酶解法生產(chǎn)飼用小肽產(chǎn)品的方法，從蛋白原料、生產(chǎn)工藝及操作參數(shù)、后加工處理方法等各個(gè)方面論述了小肽產(chǎn)品品質(zhì)的影響因素，并從常規(guī)指標(biāo)、小肽含量、小肽分子量分布、抗?fàn)I養(yǎng)因子幾方面，扼要論述了飼用小肽產(chǎn)品檢測方法和質(zhì)量甄別辦法，告知飼料企業(yè)和廣大用戶如何檢測和甄選飼用小肽產(chǎn)品。
小肽吸收機(jī)制與氨基酸不同，小肽的吸收主要依賴H+濃度或Ca2+離子濃度電導(dǎo)，是低能量消耗，逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)過程，它不同于腸細(xì)胞游離氨基酸的主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)過程，后者耗能高，易飽和，吸收速度慢。動(dòng)物吸收蛋白質(zhì)主要以小肽形式吸收，小分子活性多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)具有耗能低而不易飽和的特點(diǎn)，其吸收速度較快。研究表明，小肽的吸收對(duì)氨基酸或氨基酸殘基的吸收有促進(jìn)作用，當(dāng)以小肽為底物時(shí)，腸腔刷狀緣膜的氨肽酶活性增加，二肽酶和氨基酸載體的活性和數(shù)目也有所增加。小肽的吸收可降低游離氨基酸間的頡頑作用和競爭吸收，小肽的吸收對(duì)不同生理狀態(tài)日糧變化具有較大的適應(yīng)性，小肽的潛在營養(yǎng)作用巨大。
一、飼用小肽生產(chǎn)方法
小肽生產(chǎn)有五種方法：酸解法、堿解法、電解法、微生物發(fā)酵法和酶解法。酸解法、堿解法和電解法多使用于實(shí)驗(yàn)室研究，不適合用于飼用小肽的生產(chǎn)。
1、微生物發(fā)酵法
目前，飼用小肽主要采用微生物發(fā)酵法和酶解法進(jìn)行生產(chǎn)，從本質(zhì)上講，微生物發(fā)酵法和酶解法生產(chǎn)飼用小肽都是通過蛋白酶的酶解內(nèi)剪切作用而產(chǎn)生的。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)小肽是利用米曲霉、乳酸菌、芽孢桿菌等類能分泌蛋白酶的菌種，讓所菌種分泌的蛋白酶在微環(huán)境下酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生小肽蛋白，其肽產(chǎn)物的分子量分布大多在3000Da以上，分子量較大，屬于多肽范疇，產(chǎn)品中的肽含量和可溶物含量也有一定的限制，其產(chǎn)品中的小肽以營養(yǎng)性小肽為主。微生物發(fā)酵法的優(yōu)點(diǎn)是能較好的去除蛋白原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，生產(chǎn)成本低，在微生物發(fā)酵過程中加入乳酸菌、酵母菌、米曲霉、芽孢桿菌等，還可產(chǎn)生3%左右乳酸和發(fā)酵香味，具有酸化劑的作用，有利于提高動(dòng)物采食量，改善動(dòng)物胃腸道的微環(huán)境，具有腸益生的作用。含有益生芽孢桿菌的微生物發(fā)酵飼用小肽產(chǎn)品用于水產(chǎn)料，還可以改變水質(zhì)，優(yōu)化水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)環(huán)境，減少抗生素的應(yīng)用和疾病的發(fā)生。
2、酶解法
酶解法生產(chǎn)飼用小肽是以蛋白原料為底物，運(yùn)用蛋白酶的酶解內(nèi)剪切作用生產(chǎn)小肽，小肽分子量大多分布在2000Da以下，介于中小分子蛋白質(zhì)和氨基酸之間，某些成分具有較強(qiáng)的免疫活性。酶解法生產(chǎn)的飼用小肽，其肽含量和可溶物含量高，小肽產(chǎn)品的營養(yǎng)性好，免疫活性強(qiáng)，具有較好的抗拉稀作用。但酶解水解度較難控制，任何酶制劑和酶解條件都必然產(chǎn)生游離氨基酸和疏水性基團(tuán)，小肽產(chǎn)品有一定苦味，影響動(dòng)物采食量，產(chǎn)品需要脫苦，脫苦成本較高，脫苦工藝也給小肽產(chǎn)品品質(zhì)的控制增加了一個(gè)較難控制的工序。
3、酶解法與微生物發(fā)酵法的聯(lián)合
大多數(shù)植物蛋白原料，在單獨(dú)采用酶解方法生產(chǎn)小肽時(shí)，產(chǎn)品有較強(qiáng)的苦味，尤其是某些含有較多疏水性氨基酸的蛋白原料，比如羽毛粉，其水解物的苦味非常強(qiáng)烈，對(duì)動(dòng)物的采食有很大影響。在酶解后工藝加入乳酸菌、酵母菌等菌種進(jìn)行發(fā)酵，能夠有效去除抗?fàn)I養(yǎng)因子，產(chǎn)生乳酸等風(fēng)味物質(zhì)，減少產(chǎn)品苦味，改善產(chǎn)品品質(zhì)。但兩種方法的聯(lián)合使用也會(huì)導(dǎo)致工藝更加不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本也相應(yīng)增高。
二、飼用小肽產(chǎn)品品質(zhì)影響因素
影響飼用小肽產(chǎn)品品質(zhì)的因素很多，不同蛋白原料、蛋白原料不同的前處理方法，不同生產(chǎn)方法、工藝操作參數(shù)，不同后加工處理技術(shù)所獲得的小肽產(chǎn)品品質(zhì)往往有較大差異。
1、不同蛋白質(zhì)原料與酶的種類
不同蛋白原料被酶解獲得小肽產(chǎn)品的品質(zhì)，包括蛋白含量、肽含量、可溶物含量、營養(yǎng)性、免疫活性強(qiáng)度和免疫效果也不相同。采用酶解法生產(chǎn)飼用小肽產(chǎn)品，首先要認(rèn)真選擇酶解蛋白原料，不同的蛋白原料，其含有的疏水性氨基酸的含量和序列大不相同，尤其是疏水性氨基酸的種類和含量對(duì)酶解產(chǎn)品的適口性有很大影響，疏水性氨基酸含量高，產(chǎn)品適口性差，尤其是產(chǎn)品苦味對(duì)動(dòng)物采食有很大影響。蛋白質(zhì)原料的選擇還要考慮氨基酸的平衡性對(duì)動(dòng)物生長性能的影響。
用不同動(dòng)植物蛋白質(zhì)做原料，其胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的寡肽釋放量有所不同，表明不同的蛋白質(zhì)原料，由于氨基酸組成和序列不同，疏水性氨基酸種類和含量不同，其酶解難易程度有較大差異，比如，酪蛋白、魚粉、蠶蛹就比豆粕、玉米蛋白、豌豆蛋白、菌體蛋白、花生蛋白、綠豆蛋白、羽毛粉等容易酶解。
不同蛋白質(zhì)原料在水中的分散性有較大差異，經(jīng)過粉碎或高溫沸煮過的蛋白原料，起始酶解比較容易。容易酶解的蛋白原料，酶解條件溫和，酶解速度快，水解度容易偏高，所產(chǎn)生的游離氨基酸多，可溶物含量高，肽含量不容易控制，小肽產(chǎn)品吸水性強(qiáng)，產(chǎn)品容易結(jié)塊，生產(chǎn)包裝儲(chǔ)存有一定難度，在飼料生產(chǎn)中的使用量受到一定限制，但其產(chǎn)品中的小分子免疫活性肽的免疫活性較強(qiáng)。不容易酶解的蛋白原料，酶解條件苛刻，酶解速度較慢，水解度偏低，產(chǎn)生的游離氨基酸少，肽含量和可溶物含量低，小肽產(chǎn)品吸水性較弱，生產(chǎn)包裝儲(chǔ)存相對(duì)容易，其產(chǎn)品中的小分子免疫活性肽的免疫活性不如前者強(qiáng)。
在實(shí)際生產(chǎn)中所用的蛋白酶，比如酸性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶一般都是非專一性內(nèi)切酶，其對(duì)蛋白原料的內(nèi)切酶解作用是隨機(jī)的。對(duì)同種蛋白原料，不同的蛋白酶對(duì)其酶解的難度也不相同，但不管選用何種酶制劑和采用什么酶解條件，都會(huì)或多或少地產(chǎn)生游離氨基酸。隨著水解度的提高，蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸疏水性末端大量游離出來，小分子蛋白、小肽C-末端疏水性氨基酸殘基也不斷暴露，導(dǎo)致水解產(chǎn)物產(chǎn)生苦味。
通過調(diào)研各種蛋白原料數(shù)據(jù)庫，分析蛋白質(zhì)原料中各類氨基酸的種類、含量和序列，再次調(diào)研國內(nèi)外營養(yǎng)性小肽和免疫性小肽數(shù)據(jù)庫和各方面的研究成果，逐一核對(duì)各種蛋白原料中可能產(chǎn)生的營養(yǎng)性小肽和免疫性小肽，選用蛋白原料。根據(jù)可能產(chǎn)生的營養(yǎng)性小肽或免疫性小肽，分析其氨基酸序列及特性，比如疏水性、電子云結(jié)構(gòu)、電勢、二硫鍵、功能基團(tuán)、酶切位阻等相關(guān)信息，選定所要酶切的酶切位點(diǎn)，繼續(xù)調(diào)研蛋白酶數(shù)據(jù)庫，研究酶的特性，選擇合適的酶，有目的酶解蛋白原料，這種方法對(duì)酶解產(chǎn)品有很大的定位效應(yīng)，避免了一般酶解方法的盲目性，產(chǎn)品中營養(yǎng)性小肽和免疫性小肽的含量較高，苦味值也能控制在較低水平，產(chǎn)品質(zhì)量能夠得到較大保證。
2、酶解工藝及操作參數(shù)
相同的酶解蛋白原料，不同的工藝和操作參數(shù)，將產(chǎn)生不同的酶解結(jié)果。尤其是水解度和酶解過程的重復(fù)性難以控制，蛋白酶種類，酶添加量，底物濃度，酶解溫度，酶解過程控制，酶解過程加堿（酸）方式、方法、頻率及加堿（酸）總量對(duì)酶解最終產(chǎn)品的質(zhì)量都有很大影響。
蛋白酶水解蛋白是復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，既需要選擇專一、高效的蛋白酶制劑，又要控制水解條件。水解度的重復(fù)性依賴于對(duì)水解條件的把握和控制程度，影響水解度的因素主要有酶解溫度、酶解時(shí)間、底物濃度、加堿（酸）的頻率和總量。一般來來說，酶解時(shí)間越長、底物濃度越小、加堿（酸）的頻率和總量越大，蛋白的水解度越高，反之越小。蛋白原料的水解程度不夠，水解產(chǎn)物分子量大，小肽的產(chǎn)率就比較低；水解過度，會(huì)產(chǎn)生大量游離氨基酸，就會(huì)得不到所需要的、在一定分子量范圍的小肽產(chǎn)品。
3、發(fā)酵工藝及操作參數(shù)
微生物發(fā)酵法生產(chǎn)飼用小肽，發(fā)酵菌種的篩選、保藏、培養(yǎng)、活化、傳代對(duì)小肽產(chǎn)品的品質(zhì)有重要影響。發(fā)酵所用的乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌、米曲霉菌等菌種，一般是從相應(yīng)的產(chǎn)品中篩選得來的，篩選出來的菌種經(jīng)過誘變優(yōu)化后，用沙土管保藏。菌種的傳代數(shù)需要控制在一定的范圍以內(nèi)，當(dāng)菌種不能達(dá)到發(fā)酵產(chǎn)品的要求時(shí)，必須重新篩選或誘變優(yōu)化后才能繼續(xù)使用。
發(fā)酵接種的菌種種類、接種總量、不同菌種的接種比例對(duì)發(fā)酵小肽產(chǎn)品的品質(zhì)有較大影響，不同乳酸菌種的產(chǎn)酸量、生長速度、耐熱性、生長習(xí)性不同，不同芽孢桿菌菌種的作用不同，有的芽孢桿菌能較旺盛的分泌蛋白酶使蛋白降解，而有的芽孢桿菌卻沒有這種作用。乳酸菌和酵母菌發(fā)酵能產(chǎn)生愉悅的酸香味，但芽孢桿菌卻產(chǎn)生土腥味和氨味，因此這三種菌種的比例要恰當(dāng)。發(fā)酵工藝過程的發(fā)酵溫度，水分，傳質(zhì)效果，雜菌污染的控制，發(fā)酵過程的不同控制方法，比如多段控溫，物料的翻動(dòng)頻率等因素對(duì)小肽產(chǎn)品質(zhì)量也有較大的影響。
4、脫苦后加工處理技術(shù)
小肽脫苦有外切酶二次酶解法、活性炭吸附法、掩蓋劑掩蓋法、微生物發(fā)酵法，共四種方法。（一）外切酶二次酶解法。外切酶二次酶解法所使用的外切酶包括氨肽酶和羧肽酶，氨肽酶從小肽蛋白的氨基末端切掉氨基酸，羧肽酶從小肽蛋白的羧基端切掉氨基酸，但外切酶二次酶解所切下的氨基酸，其苦味閥值可能較低，甚至有可能是疏水性氨基酸，小肽蛋白中疏水性氨基酸可能再度暴露出來，增加苦味，因此這種方法的脫苦得不到有效保證，脫苦效果也不太明顯。在脫苦工藝中添加風(fēng)味酶，除了能產(chǎn)生外切酶酶解的效應(yīng)，還產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，生成濃香味風(fēng)味物質(zhì)，產(chǎn)品苦味有較大緩和，對(duì)動(dòng)物采食有利，但脫苦成本較高。（二）活性炭吸附脫苦法?；钚蕴课矫摽喾ㄊ窃诿附庖褐屑尤牖钚蕴?，吸附苦味肽后過濾，其脫苦效果較好，但活性炭對(duì)營養(yǎng)小肽和免疫活性肽的吸附不可避免，因此產(chǎn)品得率較低，利用價(jià)值不高，不適用于飼用小肽的生產(chǎn)。（三）掩蓋劑掩蓋法，掩蓋劑掩蓋法是在酶解液中添加酸味劑、甜味劑或其它疏水基團(tuán)包被劑掩蓋苦味，掩蓋劑具有誘食作用，成本較低，感官評(píng)定顯示，產(chǎn)品甜味和酸味過后仍能品嘗到較濃的苦味。（四）微生物發(fā)酵法脫苦。在酶解的后段工序中，加入乳酸菌、酵母菌等厭氧發(fā)酵，可以起到綜合脫苦的效果，同時(shí)產(chǎn)生乳香味和酒香味等風(fēng)味物質(zhì)，產(chǎn)品的誘食性較好。
三、飼用小肽產(chǎn)品的檢測
1、常規(guī)指標(biāo)
常規(guī)指標(biāo)的檢測包括：顏色、氣味、粒度、口感、水分、粗蛋白、真蛋白、可溶物、鈣、可利用磷、氨基酸含量、比重、乳酸含量、1%溶液pH值。消化能、代謝能、總能的檢測比較復(fù)雜，一般要送到研究機(jī)構(gòu)去測定。
除國標(biāo)測定方法外，其它一些方法雖然是感官指標(biāo)，但也能從一定程度上反映出產(chǎn)品的質(zhì)量。比如，產(chǎn)品的顏色比較深，說明屬于深度固態(tài)發(fā)酵，產(chǎn)蛋白酶比較多，小肽含量比較豐富，這種產(chǎn)品可溶物含量往往也比較高。
2、小肽含量
飼用小肽產(chǎn)品中，小肽含量是表現(xiàn)小肽產(chǎn)品中是“肽”，而非 “原蛋白”或“游離氨基酸”的一個(gè)最重要的技術(shù)指標(biāo)。蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解，其水解中間產(chǎn)物為胨、肽等，最終產(chǎn)物為氨基酸，肽產(chǎn)品的總蛋白質(zhì)含量包括未被水解的蛋白質(zhì)和所有水解中間產(chǎn)物，如部分水解蛋白、胨、肽及游離氨基酸的總量。小肽的分子量小于2000道爾頓，小肽含量指標(biāo)反映了產(chǎn)品中小肽的實(shí)際含量。
肽含量是通過檢驗(yàn)產(chǎn)品中酸溶蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量，經(jīng)計(jì)算差值而得。酸溶蛋白質(zhì)是指能夠溶解于15％TCA（三氯乙酸）溶液的可溶性蛋白，測定中除去了未水解的較大分子量的蛋白質(zhì)，其結(jié)果顯示出產(chǎn)品中（分子量在2000Dalton以下的）肽的含量。這種方法的測定結(jié)果對(duì)肽含量的范圍比較敏感，一般只能對(duì)肽含量大于15%的產(chǎn)品測定有實(shí)際意義，對(duì)低肽含量的產(chǎn)品，需要繼續(xù)改造才能比較。比如，把用15%TCA沉淀改成用一定濃度的乙醇溶液沉淀，測量的結(jié)果可能有新的變化。
超濾膜超濾法是目前測定小肽總含量比較簡便的方法，產(chǎn)品溶解后，經(jīng)初步離心，上清夜分別通過截留分子量為100Dalton與10000Dalton的超濾膜，然后進(jìn)行氨基酸含量測定，測定結(jié)果就是分子量在100Dalton至10000Dalton的小肽段組分的含量。如果要測定其它肽段組分的含量，可以改換成相應(yīng)分子量孔徑的超濾膜。這種測定方法比較精確，測量分子量范圍也可以方便調(diào)節(jié)，但要求每次使用一個(gè)超濾膜管，有氨基酸自動(dòng)分析儀，12000r/min高速離心機(jī)。
3、小肽蛋白的分子量分布
分子量分布是肽產(chǎn)品的重要特性指標(biāo)，直接反映著產(chǎn)品中不同分子量大小肽類的構(gòu)成特征。肽類分子量大小最經(jīng)典的方法是測定肽鏈長度法，即TNBS法。這種方法是通過測定水解過程中產(chǎn)生的游離氨基酸，推算出水解度，再通過水解度計(jì)算出平均肽鏈長度。這種方法只能概括地表示出樣品中所有大分子及小分子蛋白水解物的平均分子量，不能直觀地反映出樣品中蛋白水解物的分子量分布情況。
測定蛋白質(zhì)及肽類分子量的另一個(gè)方法是層析比色法。通過層析柱將不同分子量的蛋白質(zhì)或氨基酸一一分開，用比色法測定其濃度，再采用已知分子量的蛋白質(zhì)和肽類做標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出一定分子量范圍肽類的含量。該方法與以前的方法相比有很大進(jìn)步，但基本上仍屬化學(xué)法，操作繁瑣，人為誤差較大。
測定蛋白類物質(zhì)分子量最新的方法當(dāng)屬高效凝膠色譜法。該法是在層析比色法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了儀器自動(dòng)化的改進(jìn)，準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好、數(shù)據(jù)處理科學(xué)，能真實(shí)地表示出蛋白質(zhì)和肽類的分子量分布。分子量分布的測定不但能定性地鑒定肽類產(chǎn)品的優(yōu)劣、真?zhèn)?，而且能定量地表示出不同分子量范圍的肽的百分含量。在肽行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，采用高效凝膠色譜法作為肽分子量分布的檢測方法是技術(shù)上的一種突破，能分析鑒定產(chǎn)品的純度，區(qū)分出什么是“蛋白質(zhì)”，什么是“肽”，有利于宣傳和推廣“肽”這一新產(chǎn)品概念。
采用高效凝膠過濾色譜法和液相色譜法測定分子量分布，需要系統(tǒng)地研究樣品的前處理方法、色譜條件、色譜柱、流動(dòng)相、分子量校正曲線等因素，并經(jīng)過數(shù)據(jù)處理和軟件分析，可以準(zhǔn)確地測定水解物中肽分子量分布，要求條件很高，一般只適合研究所和高校使用。
利用高分子蛋白質(zhì)(分子量MW≥2300)易為單寧在酸性條件下沉淀的原理，將肽液酸化后,加植酸鈉使高分子物質(zhì)沉淀，再加單寧使中分子物質(zhì)沉淀,按GB/T5009.5-85分別測定濾液或?yàn)V渣中蛋白質(zhì)含量，根據(jù)隆丁區(qū)分法,計(jì)算高、中低分子量小肽蛋白的百分含量，也可以從一定程度上反映出不同蛋白肽分子量區(qū)段的分布情況。只要有測定粗蛋白含量能力的企業(yè)都能用這種方法測定，但這種方法所反映的情況比較粗略。
4、抗?fàn)I養(yǎng)因子
豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子主要包括大豆抗原、致甲狀腺腫素、脂肪氧化酶、胰蛋白酶抑制因子、脲酶活性、植酸、大豆凝血素等。抗?fàn)I養(yǎng)因子的指標(biāo)比較多，測定非常煩瑣。從大豆粕數(shù)據(jù)庫中了解到，脲酶的活性和胰蛋白酶抑制劑的含量可以大致衡量發(fā)酵豆粕中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的情況。通過垂直板凝膠電泳測定分子量情況，以標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白做為標(biāo)準(zhǔn)區(qū)帶，進(jìn)行比對(duì)，可以從一定程度上看出抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除情況。一般來說，我們認(rèn)為，脲酶的活性以定性檢測24小時(shí)不變紅，胰蛋白酶抑制劑與大豆粕比較，相對(duì)含量10%左右，通過垂直板凝膠電泳測定分子量在20000Dalton以下，說明抗?fàn)I養(yǎng)因子去除比較完全。

dongwei

不要去追求小肽的概念，目前在人或動(dòng)物營養(yǎng)界都還是個(gè)糊涂帳，把現(xiàn)有的蛋白原料經(jīng)過發(fā)酵，生產(chǎn)出好的產(chǎn)品就可以了。

fuhuowy

受益了，謝謝！