雞熱應激與熱應激蛋白的作用機理研究

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雞熱應激與熱應激蛋白的作用機理研究

[編者按] 高溫導致畜禽熱應激問題的危害正日益突出并倍受關注。針對這些問題本刊推出“熱應激專欄”，目的是為緩解夏季普遍存在的畜禽熱應激提供理論和技術支持，使從業(yè)者能通過一些技術手段來規(guī)避熱應激帶來的損失。由于時間的倉促，本期組織的稿件內(nèi)容覆蓋面不是很全，但是以后會陸續(xù)推出有關內(nèi)容，希望大家能繼續(xù)關注。同時我們也希望專家、學者能踴躍地發(fā)表真知灼見與廣大讀者分享，把熱應激理論、防制調控推到一個更高的階段。 白水莉 章世元 劉大林 隨著集約化高密度畜禽飼養(yǎng)方式的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境問題已成為影響當前養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要因素之一。在畜牧生產(chǎn)實踐中，人們?yōu)榱俗非筝^高的生產(chǎn)水平，提高經(jīng)濟效益，一方面所采用的生產(chǎn)方式和技術措施嚴重地背離了畜禽在長期進化過程中所形成的對環(huán)境條件的需求和生理規(guī)律，從而造成生產(chǎn)力低下，嚴重時引起畜禽大批死亡；另一方面與環(huán)境控制密切相關的禽舍環(huán)境溫度得不到有效的控制，從而使大部分地區(qū)難以抵御夏季高溫對家禽生產(chǎn)所帶來的環(huán)境壓力，給養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。 高溫熱應激是畜禽生產(chǎn)中最常見的應激源，不論是夏季持續(xù)高溫，還是季節(jié)交替的驟變高溫，都會引起家禽生長受阻、繁殖力和肉品質下降，甚至引起多種疾病和家禽的大批死亡，給生產(chǎn)帶來很大的經(jīng)濟損失。高溫熱應激問題的危害正日益突出并受到關注，因此，研究高溫熱應激問題及其作用機理、有效緩解和消除高溫熱應激將對提高禽類產(chǎn)品的競爭力和養(yǎng)禽業(yè)的經(jīng)濟效益有很大的現(xiàn)實意義。這已成為眾多學者和畜牧生產(chǎn)者關注的一個熱點問題。 1 熱應激和熱應激蛋白的概念 1.1 熱應激的概念 由于外界環(huán)境溫度過高，體溫調節(jié)及生理機能紊亂而發(fā)生的一系列異常反應，并出現(xiàn)生產(chǎn)性能下降，甚至出現(xiàn)休克和死亡等現(xiàn)象叫熱應激。往往蛋雞處于25 ℃以上，肉雞28 ℃以上就會出現(xiàn)熱應激反應。 因為高溫熱應激源的刺激過強、過長或雞體自身對應激源的致敏性增強時，雞的正常生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，正常生理功能與生理狀態(tài)發(fā)生異常。應激分為警戒期、抵抗期和疲勞期三個階段。警戒期又分為兩類即休克狀態(tài)和抗休克狀態(tài)。在警戒期的休克狀態(tài)時雞體內(nèi)促腎上腺皮質激素(ACTH)的生成量和釋放量增加，引起腎上腺功能亢進，腎上腺和垂體前葉增生腫大，最終導致腎上腺皮質激素分泌極度減少，此時機體抵抗力降低，若有病原菌侵入，極易發(fā)病，甚至死亡。 1.2 熱應激蛋白的概念 從低等動物細菌到高等動物人類，受高溫作用后均可發(fā)生熱應激反應，此反應的特點是選擇性合成一組多肽，稱熱應激蛋白(heat stress proteins, HSPs)，又稱熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)、應激蛋白(stress proteins, SPs)，它是一種保護機體的蛋白。 2 熱應激蛋白的類型 熱應激蛋白(HSPs)普遍存在于從細菌到高等真核生物包括人的整個生物界，并且可以被氨基酸類似物、生長因子、重金屬離子、病毒感染等多種因素誘導。熱應激蛋白其實質并不是一個蛋白或一類蛋白而是一個龐大的家族。熱應激蛋白家族是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為保守的遺傳系統(tǒng)。根據(jù)氨基酸序列的同源性、分子量和功能的不同，HSPs可分為HSP110、HSP90（83～90 kDa）、HSP70（66～78 kDa）、HSP60、HSP40和小分子HSP（15～30 kDa）家族。 每個這樣的HSPs族都由一個或多個不同形式或不同程度修飾的高度同源的蛋白質分子組成。同一族的成員除相對分子量大小相似以外，還具有一些共同的特征，不同種屬的細胞含有相似的HSPs族，但不同族之間同源性較低。例如，HSP70與HSP90之間幾乎沒有同源性。此外，每一個特定的族在種族發(fā)育過程中是高度保守的，如細菌和人類的HSP70分子之間非常相似。在不同生物體中分布于相同細胞器中的熱應激蛋白的相似性通常強于來源于同種生物卻在細胞內(nèi)定位不同的蛋白，這也表明各種HSPs族的功能與其在細胞內(nèi)的分布有關。 3 熱應激蛋白的特性 3.1 熱應激蛋白基本特點 由于HSPs具有高度應激性和高表達性，提高了機體對應激的抵抗力，從而引發(fā)越來越多的學者對HSPs 的研究興趣。HSPs 在進化上具有高度保守性，能與細胞蛋白結合行使功能，故又稱為伴侶分子?？偨Y前人研究成果，熱應激蛋白存在以下特點：①在正常細胞中非應激狀態(tài)下水平較低， 而應激狀態(tài)下可迅速顯著升高，可達正常水平的數(shù)十倍。②正常生理狀態(tài)下，HSPs主要存在于細胞質中；應激狀態(tài)時HSPs迅速進入細胞核和核仁；應激恢復期，又迅速進入細胞質；當再次應激時，HSPs返回細胞核。③HSPs可被多種刺激誘導而大量產(chǎn)生，具有應激反應普遍性。④HSPs可以提高細胞抗應激能力，其生成量與細胞的耐熱力呈正相關。 HSPs基因除了在一定的真核細胞內(nèi)表達外，這類基因還能夠被一定的應激原激活，即當機體出現(xiàn)明顯的平衡失調和生理性差異時，且這些差異影響著蛋白質結構的某些方面的功能，例如通過變性，使得氨基酸片段發(fā)生轉換或共價修飾，從而獲得應激。 3.2 熱應激蛋白在抗熱應激中熱耐力的特點 熱耐力是指機體對熱作用的耐受能力，預先給生物以非致死性的熱應激,可以加強生物對第二次熱刺激的抵抗力,提高生物對致死性熱刺激的存活率,這種現(xiàn)象稱為熱耐力。在高溫等有害因素作用下，生物機體內(nèi)出現(xiàn)應激反應，而熱應激蛋白是否能被正常激活，決定了機體熱耐力的形成。主要表現(xiàn)在生物體在接觸亞致死溫度后對致死性高溫產(chǎn)生耐受性，熱耐力提高以后，可以提高機體在致死高溫下的生存能力。 人們通過許多實驗從各個方面證實了HSPs與熱耐力確實有關，表現(xiàn)如下：①當熱應激時，許多生物和細胞的HSP70 可迅速被誘導，而且增加幅度很大。②隨著HSPs表達增強，機體對熱的耐受能力也迅速增強。③給正常細胞轉入HSPs 基因,使其高表達,細胞熱耐力增強。④使一個或幾個編碼HSPs的基因不表達, 細胞抗熱休克能力減弱或消失。有人通過抑制或滅活細胞的基因表達，發(fā)現(xiàn)細胞熱耐力降低。也有人用基因敲除（knock out）的方法去除細胞的HSPs基因,得到了相似的結果。⑤不同種屬生物熱耐力的差別與HSPs基因的表達程度密切相關。HSPs可以在機體熱應激時加快正常蛋白質合成的恢復,使熱休克時由于蛋白變性而造成的蛋白質量的減少得到補充,因此使機體獲得熱耐受力。 HSPs賦予細胞或生物從各種應激中恢復的能力,并保護它們免遭應激因素的損害。其中,表現(xiàn)最為明顯的是熱耐受能力的形成,即當細胞或生物接觸非致死溫度后,表現(xiàn)對致死溫度的存活率明顯提高。在熱耐力的形成中,主要是熱應激蛋白HSP70起主要作用。它的編碼基因的5'端含有一段約 14對堿基的保守序列，對HSP70 mRNA的轉錄具有啟動作用。在熱應激反應時，熱應激蛋白的變化主要取決于轉錄和翻譯上的調節(jié)。轉錄水平主要由熱應激轉錄因子（heat shock transcrirtional factors, HSF）調節(jié)，它能識別被稱為熱應激元件（heat shock element, HSE）的靶序列。 高溫環(huán)境熱應激可誘導幾乎所有組織細胞合成HSP70，其細胞保護作用已基本確認，但HSP70增強熱耐力的作用機制不完全清楚。普遍認為這種廣泛存在、高度保守的HSP70是細胞保護的物質基礎,作為對適應和抵抗熱應激有重要作用的HSP70基因，在不同的地方雞品種中可能存在差異。因此，有必要充分利用我國豐富的家禽基因庫資源，從中尋找雞HSP70基因的多態(tài)性，并闡明多態(tài)位點在不同雞種中的分布特征，為研究和利用HSP70基因作為潛在的抗熱性標記輔助選擇的候選基因奠定基礎。 在高溫熱應激源的刺激下，使熱應激蛋白的含量增加的同時應激蛋白也可促使動物體溫升高。據(jù)俄國《科學信息》雜志報道，俄羅斯科學院謝切諾夫生理進化與生物化學研究所和細胞學研究所專家通過實驗證實：在高溫、寒冷和感染等條件刺激下，動物體內(nèi)的應激蛋白可促使動物體溫升高，以提高機體免疫力。應激蛋白在活體細胞內(nèi)部合成，可使生物細胞在應激反應中存活下來。俄國研究人員認為，細菌脂多糖是致病微生物細胞膜的一種成分，而應激蛋白既可以通過傳播細菌脂多糖特有的感染信號的方式，又能通過從細胞外部刺激細胞的方式使負責發(fā)熱反應的動物下丘腦前端工作起來，提高動物的體溫，激發(fā)其免疫系統(tǒng)，從而提高機體的免疫能力?！?br /> 4 熱應激蛋白的功能 HSPs幾乎存在于所有生物體內(nèi)的各種細胞中，當細胞受到損傷時，均伴隨著HSPs含量的增加，大量的資料表明，HSPs在熱耐力形成過程中維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。一些資料表明熱耐力與HSPs的表達呈正相關，因此現(xiàn)在普遍認為HSPs的功能主要在于穩(wěn)定細胞的結構，使細胞維持正常的生理功能。熱應激蛋白在細胞生長、發(fā)育、分化、基因轉錄，蛋白質的合成、折疊、運輸、分解及其膜和細胞骨架的形成等多方面發(fā)揮著重要的作用。 4.1 HSP70家族的主要功能 HSP70家族包括分子量為72、73、75、78 kDa等的蛋白質，是HSPs家族中最豐富的一種，HSP70可參與蛋白質的代謝。高溫熱應激時,雞體為了適應環(huán)境,各臟器組織充分發(fā)揮自我生理調節(jié)作用可誘導雞大腦、肝臟、肺、心臟等組織中HSP70的產(chǎn)生增加。HSP70、HSP70 mRNA在各臟器組織中的表達水平各異。HSP70主要在心、肝組織中大量表達,且與肛溫變化一致，可能是因體溫升高，誘發(fā)熱應激基因開放。Gabrief等在對肉雞的熱應激中發(fā)現(xiàn)HSP70 mRNA量在35 ℃、3 h達到最高值，這說明HSP70 mRNA受熱誘導的增加具有時間依賴性。若應激過強或時間過長，HSPs在應激中表達量降低，導致細胞和機體嚴重受損。隨著HSPs的增多,細胞存活率增高、受損輕,特別是熱適應后細胞損傷更輕,顯示出HSP70對細胞的保護作用。因此常把HSPs作為細胞損傷的一個客觀指標和熱應激的敏感指標。 4.2 HSPs其它家族的功能 近年來研究證實HSP60在自身免疫性疾病、傳染病、慢性感染的發(fā)病中均發(fā)揮重要作用。HSP90在細胞內(nèi)具有重要的生理功能，HSP90在組織細胞內(nèi)有很高的基因表達，參與細胞周期調控，還參與免疫和免疫調節(jié)作用 。禽類HSP108最早發(fā)現(xiàn)于1981年，其主要功能是作為蛋白受體，具有免疫原性。由于應激反應的普遍性及HSPs高表達提高了機體對應激的抵抗力。 5 熱應激蛋白在熱應激中的作用機理 李培慶等應用3H-Dex放射配體結合的Scatchard分析和35S-蛋氨酸體外標記法分別測定了環(huán)境溫度40 ℃熱應激時，雞外周血淋巴細胞(PBL)的糖皮質激素受體(GR)的最大結合容量(Ro)、平衡解離常數(shù)(Kd)及其熱休克蛋白的表達，結果顯示在熱應激處理后0.5～4 h雞細胞熱休克蛋白(HSPs)的合成持續(xù)增加，在熱應激最初0.5 h細胞總的蛋白合成迅速下降而HSPs合成增加，主要有HSP100、HSP90、HSP70和HSP25。在這些HSPs 4 h內(nèi)合成增加的過程中，糖皮質激素受體（GR）含量迅速下降，細胞總的蛋白的合成也逐漸恢復。這可能由于HSPs廣泛地參與到細胞骨架和核骨架的形成中，與細胞的功能有著密切的聯(lián)系。因為核仁對熱特別敏感，因此可以推測在熱應激早期由于細胞核的受損從而使蛋白質合成的mRNA轉錄受阻，而抑制了蛋白質的合成。HSPs在熱應激過程中對細胞結構和機能的重建，維持激素與糖皮質激素受體（GR）的親合力，穩(wěn)定受體蛋白結構，提高機體熱耐受力具有重要意義。 Welch和Suhan在觀察應激及應激恢復期哺乳動物細胞時發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱休克的細胞，許多核蛋白變?yōu)椴豢扇懿⒊蔀榛|的一部分。在應激過程中合成的HSP70可向細胞核遷移并以親水的方式結合到基質上，然后再集中到細胞核里，加速熱休克的核仁恢復正常，修復被損傷的前核糖體。HSP25等小分子HSPs在熱耐受方面尤為重要，它們在結構上具有較高的保守性，可以形成緊密的聚合結構——熱休克顆粒。有實驗證明，抑制小分子HSPs(22~32 kDa)產(chǎn)生，能夠導致細胞熱保護性喪失。另外，小分子HSPs還能參與聚合蛋白質的解聚和異常蛋白質的降解。因此，熱休克過程中HSPs合成增加可增強細胞的熱耐受力，促進和提高細胞從應激狀態(tài)中恢復正常功能。熱應激時誘導產(chǎn)生的大量的HSPs可能參與調節(jié)維持激素與受體的親合力，穩(wěn)定受體構象，以保證有效的受體數(shù)量，來發(fā)揮其生物學效應。 HSPs的合成可能參與穩(wěn)定細胞內(nèi)包括受體蛋白在內(nèi)的其它蛋白的結構形成，促進變性蛋白的復原，對損傷的組織細胞有減輕再損傷的作用。因此，糖皮質激素（GC）、糖皮質激素受體（GR）及HSPs的綜合調節(jié)對特殊環(huán)境下生物體的適應性生存具有重要意義。 6 小結 我們研究問題的最終目的是要尋找出解決問題的方法。通過對雞熱應激與熱應激蛋白的作用機理的探討，本人認為解決此問題可從以下幾方面入手：①由于先天遺傳因素對機體適應外界各種環(huán)境起著很大的作用，可利用基因導入法在培育雞品種時，轉入HSPs基因使其細胞能高度表達,來增強雞的耐高溫抗熱應激能力。②利用熱應激蛋白在熱應激中熱耐力的特點，在夏季高溫天氣到來之前可以人為逐步增加禽舍溫度以使其能產(chǎn)生熱耐力以便能適應夏季高溫環(huán)境。 HSPs是生物體(或離體培養(yǎng)細胞)在應激因素作用下所產(chǎn)生的一組特殊蛋白質,它能保護機體(或細胞)不受或少受損傷。目前，迫切需要完善一系列的方法和熱應激蛋白的理論，尤其是將基因組學及蛋白組學及分子生物學技術結合起來，應用于生產(chǎn)實踐,使其在生命科學發(fā)展中發(fā)揮巨大的作用。

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