12種水溶性維生素化合物的快速、同時分析

wangheping

12種水溶性維生素化合物的快速、同時分析

Eleanor Riches,Waters 公司， Manchester，UK.

目的

應(yīng)用兼容快速質(zhì)譜采集速率的 Waters? ACQUITY? 超高效液相色譜（UPLC?），來提供一種快速而且有選擇性的方法，在4min的運行時間中同時分析12種水溶性維生素化合物。

簡介

針對全球飲食不足的現(xiàn)狀，食品生產(chǎn)商正依法增強許多食品和飲料產(chǎn)品，以增加消費者的營養(yǎng)水平。一旦維生素化合物被添加到消費品中，這個信息應(yīng)該在相關(guān)的包裝中明確標識出來，而且要和嚴格的法規(guī)要求一致，如歐洲法規(guī)（ EC）No. 1925/2006 1 關(guān)于食品中維生素和礦物質(zhì)的添加；包含飲食增補的歐洲指令 2002/46/EC 2 ；或美國聯(lián)邦法規(guī)全書（CFR）標題21的101部分-食品標記 3 。

食品生產(chǎn)商需要快速的、可信賴的和利潤高的方法來分析他們的產(chǎn)品中的營養(yǎng)組分，以確保他們的標簽聲明可以被證實。維生素經(jīng)常是存在的，即使是被強化之后，在挑戰(zhàn)性的基質(zhì)中的濃度水平仍然很低，這就使得準確分析很費力。

現(xiàn)在，水溶性維生素化合物都是單獨分析的，或在小組里，使用廣大范圍的不同的分析方法，如微生物測試法、比色法、滴定法、熒光法和HPLC方法 4 。這就意味著分析實驗室需要一筆可觀的費用用于各種各樣不同儀器的財政支出，以便于多種維生素分析，同時如果有一系列的分析需要進行的話，還需要投入大量的員工時間和努力。所以，一個快速的、選擇性好的解決方案的同時分析水溶性維生素化合物的能力，可以給商業(yè)帶來以下潛力：提高生產(chǎn)率、由于提高了效率而引起的財政收入的增加、加速樣品周轉(zhuǎn)，以及減少勞動力和培訓(xùn)成本。

這篇應(yīng)用文獻描述了一個用來同時分析12種用于增補或增強食品和飲料的水溶性維生素化合物的快速的、選擇性好的解決方案。這個方案尤其適用于希望得到與UV檢測器相比更高靈敏度、更高選擇性和更快的樣品周轉(zhuǎn)時間的水溶性維生素分析物。

實驗

整個制備和分析過程中，所有的溶液都要避光，并且保存在 <5℃條件下。

LC條件

LC系統(tǒng)： ACQUITY UPLC?系統(tǒng)

色譜柱： ACQUITY UPLC HSS T3, 2.1×50mm, 1.7um

柱溫： 40℃

樣品室溫度： 4℃

流速： 0.6mL/min.

流動相 A： 990mL水：10mL 1M的甲酸銨（aq）：1mL甲酸

流動相 B： 990mL甲醇：10mL 1M的甲酸銨（aq）：1mL甲酸

梯度： 0.00min 99% A

2.00min 99% A

3.00min 45% A

3.10min 99% A

4.00min 99% A

弱洗針溶液：0.1%甲酸水溶液

強洗針溶液： 0.1%甲酸甲醇溶液

總運行時間： 4min

進樣體積： 20uL，滿環(huán)進樣模式

進樣針類型： 不銹鋼（超級潔凈）針

MS條件

MS系統(tǒng)： ACQUITY TQD

電離模式： ESI+

噴霧電壓： 1kv

脫溶劑氣： 氮氣，800L/Hr，450℃

錐孔氣： 氮氣，10L/Hr

源溫度： 120℃

采集模式： 多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）

碰撞氣： 氬氣，壓力為3.5×10 -3 mBar

與通用檢測器相比，ACQUITY TQD質(zhì)譜儀的優(yōu)勢在于象食品樣品之類的復(fù)雜基質(zhì)仍可以得到的選擇性和靈敏度增加。當(dāng)MS使用了MRM模式，只有特殊的、可以代表所感興趣的維生素的離子才被選擇。這也意味著運行時間可能減少，因為色譜峰不需要象UV或熒光檢測器那樣必須根據(jù)保留時間分離開來。待分析化合物的MRM通道、其它的質(zhì)譜參數(shù)和預(yù)計的保留時間都列在表1 。

維生素化合物	保留時間	MRM通道	錐孔電壓（ V）	碰撞能（ eV）
抗壞血酸 （ C）	0.40	177 > 144	24	8
硫胺（ B1）	0.45	265 > 122	24	17
煙堿酸（ B3）	0.53	124 > 80	38	20
吡哆醛（ B6）	0.67	168 > 150	27	15
吡哆醇（ B6）	0.89	170 > 152	28	14
煙堿（ B3）	0.93	123 > 80	40	20
泛酸鈣（ B5）	2.77	242 > 153	30	15
氰鈷胺素（ B12）	3.02	678 > 147	36	34
葉酸（ B9）	3.03	442 > 295	23	17
核黃素 -5'-磷酸鹽（B2）	3.07	457 > 439	41	18
生物素（ B7）	3.14	245 > 227	28	13
核黃素（ B2）	3.15	377 > 243	42	22

表 1. 監(jiān)測的MS/MS離子通道、MS參數(shù)和預(yù)計的保留時間。

采集和處理方法

這些數(shù)據(jù)都用 Waters' MassLynx TM v. 4.1軟件采集。嵌入到MassLynx中的IntelliStart TM 技術(shù)可以自動優(yōu)化MS參數(shù)，而不需要有經(jīng)驗的MS操作人員來開發(fā)MS方法。IntelliStart也可以監(jiān)控LC/MS系統(tǒng)的健康狀態(tài)，從而減少了操作者以前必須的維護和保養(yǎng)時間。自動化的系統(tǒng)審查可以按預(yù)設(shè)的時間表進行，即使是在工作時間之外，一個簡單的、可視的系統(tǒng)健康信息也可以提供給操作者。

數(shù)據(jù)處理通過使用TargetLynx TM 應(yīng)用管理器進行，這個定量包可以自動數(shù)據(jù)處理和報告。

相似的數(shù)據(jù)采集和處理也可以通過使用Empower TM 軟件進行。

圖 1. 12種不同的水溶性維生素標準溶液的提取離子色譜圖。

a濃度=50pg/uL；b濃度=50ng/uL；c濃度=10pg/uL；d濃度=0.5pg/uL；e濃度=100pg/uL.

結(jié)果和討論

12種水溶性維生素化合物的分析可以應(yīng)用ACQUITY UPLC 和采用MRM模式的ACQUITY TQD。MRM模式中的化合物專屬通道可以開發(fā)出快速而且選擇性好的、在4min內(nèi)所有感興趣的化合物共流出的解決方案。

在食品和飲料中發(fā)現(xiàn)的代表最低水平濃度的 12種水溶性維生素化合物標準的提取離子色譜圖顯示在圖1中。它表明了該解決方案既快速又有好的選擇性，而且這種類型分析的峰形都很好。

圖 2 飲食增補維生素片的提取離子色譜圖。

這個分析程序在兩種不同的基質(zhì)中檢測過，可是，色譜和質(zhì)譜條件可以應(yīng)用于經(jīng)過適當(dāng)提取的不同基質(zhì)。分析物列表包括了不僅一種形式的復(fù)合維生素 B，這使得它的應(yīng)用盡可能的廣泛；所以只有片劑或嬰幼兒調(diào)制奶粉使用的形式被檢測。

第一個被檢測的基質(zhì)是維生素片劑。一個品牌的飲食增補維生素片劑的提取離子色譜圖顯示在圖 2中。

通過分析得到的維生素片劑的計算濃度和峰面積%RSD值，都列在了表2 中。當(dāng)應(yīng)用到維生素片劑時，%RSD值是這種分析的高水平重復(fù)性的象征。

維生素B12通常是食品和飲料商品中添加的最低濃度的水溶性維生素化合物。結(jié)果，多維生素分析中的B12含量是經(jīng)常變化的。這里描述的解決方案對于同時分析維生素B12、復(fù)合維生素B和維生素C是耐受的，而且選擇性好。維生素B12的峰形和保留時間如圖3 所示的那樣，多次進樣之后，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性都很好。

維生素化合物	計算得到的濃度 （ ng/mL）	峰面積 %RSD （ n=6）
抗壞血酸 （ C）	135	2
硫胺（ B1）	4	1.2
煙堿酸（ B3）	15.6	0.4
吡哆醛（ B6）	-	不存在
吡哆醇（ B6）	5.6	0.2
煙堿（ B3）	-	不存在
泛酸鈣（ B5）	12	2.8
氰鈷胺素（ B12）	0.0039	4.6
葉酸（ B9）	2.4	2.4
核黃素 -5'-磷酸鹽（B2）	-	不存在
生物素（ B7）	0.82	1.7
核黃素（ B2）	4.1	1.2

表 2 從飲食增補維生素片劑提取出來的水溶性維生素化合物的計算濃度和面積%RSD。

圖 3 從飲食增補維生素片劑提取出來的維生素B12色譜峰（n=6，濃度=3.9pg/uL）。

分析條件也在更具挑戰(zhàn)性的嬰幼兒配制奶粉基質(zhì)中測試過。一個品牌的嬰幼兒配制奶粉的提取離子色譜圖，如圖 4 所示。

圖 4 嬰幼兒配制奶粉分析的提取離子色譜圖。

通過分析得到的嬰幼兒配制奶粉基質(zhì)的計算濃度和峰面積 %RSD，都列在表3。這些%RSD值都是通過相對原始的、用于非常復(fù)雜基質(zhì)的提取方法得到，顯示了該解決方案的耐受性。

維生素化合物	計算得到的濃度 （ ng/mL）	峰面積 %RSD （ n=6）
抗壞血酸 （ C）	19.8	14.7
硫胺（ B1）	0.93	5.4
煙堿酸（ B3）	-	不存在
吡哆醛（ B6）	-	不存在
吡哆醇（ B6）	0.45	6
煙堿（ B3）	4.7	11.7
泛酸鈣（ B5）	3.1	11.7
氰鈷胺素（ B12）	0.0024	3.5
葉酸（ B9）	0.34	6.7
核黃素 -5'-磷酸鹽（B2）	-	不存在
生物素（ B7）	0.041	5.3
核黃素（ B2）	2.1	5.5

表 3 嬰幼兒配制奶粉中提取得到的水溶性維生素化合物的計算濃度和峰面積%RSD。

結(jié)論

一個快速的、選擇性好的、應(yīng)用 ACQUITY TQD MRM模式的解決方案被開發(fā)用來在4min的運行時間內(nèi)，同時分析12種水溶性維生素化合物，這樣就免去了每個化合物的分離分析程序。飲食增補維生素片劑和嬰幼兒配制奶粉的分析表明該解決方案適用于廣大范圍不同種類的基質(zhì)。

如圖 5所示的ACQUITY UPLC/TQD系統(tǒng)可以提供：

&#8226;  與傳統(tǒng)的 HPLC方法相比，可提高色譜分離度、縮短分析時間。

&#8226;  IntelliStart技術(shù)被設(shè)計用來減少復(fù)雜操作、新使用者培訓(xùn)，以及時間消耗型維護和保養(yǎng)的負擔(dān)。

&#8226;  更小的儀器尺寸，可以為任何實驗室節(jié)約空間。

圖 5 ACQUITY UPLC系統(tǒng)和ACQUITY TQD質(zhì)譜。

這個系統(tǒng)解決方案，融合了 ACQUITY UPLC的色譜分離速度和ACQUITY TQD質(zhì)譜的選擇性，可以將12種水溶性維生素化合物的分析融合到一針進樣分析。這可以使財政緊張的實驗室由于可以節(jié)約分析時間而提高效率，通過增加樣品通量提高利潤，以及有更好的生產(chǎn)率。另外，通過減少實驗室消耗品的使用可以節(jié)約成本，同時由于減少了試劑使用而減少了對環(huán)境的影響。

這個解決方案可以為水溶性維生素分析的流線型方法提供理想的基礎(chǔ)，因為它不需要多個方法，可以使分析人員用一個快速而簡單的程序分析所有的復(fù)合維生素B和維生素C..

ddgs500

很專業(yè)，頂一下，不過很多沒看明白的地方。