轉(zhuǎn)載霉形體

jufengs · 發(fā)表于 2010-1-10 11:46:31

第二十五章霉形體（Mycoplasmas）

第一節(jié)
概述

霉形體又稱支原體，是一類沒有細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物。細(xì)胞膜含固醇，能通過(guò)0.45um濾菌器；但呈二分裂繁殖，含DNA與RNA。霉形體是目前所知能在無(wú)生命培養(yǎng)基中繁殖的最小微生物。過(guò)去曾稱為類胸膜肺炎微生物(pleuropneumonia-likeorganism，PPLO)，由于它們能形成有分枝的長(zhǎng)絲，故稱之為支原體。霉形體因其沒有細(xì)胞壁故歸屬于柔膜體綱（Mollicute)的支原體目(Mycoplasmatales)。下分3個(gè)科：支原體科(Mycoplasmataceae)；無(wú)膽甾原體科(Acholeplasma-taceae)，生長(zhǎng)時(shí)不需要外源性膽固醇；螺原體科(Spiroplasmataceae)，生長(zhǎng)至一定階段呈螺形。在支原體科中又分支原體(Mycoplasma)和脲原體(Ureaplama)2個(gè)屬。支原體屬現(xiàn)知有64個(gè)種，而脲原體屬僅2個(gè)種。

一、歷史

1898年法國(guó)人Nocard
Roux
從患有胸膜肺炎的病牛中分離到一種病原體。既不同于細(xì)菌也不同于病毒，將該病原體稱為胸膜肺炎微生物（Pleuropneumonia
organism，ppo）。后來(lái)許多學(xué)者從廣泛的宿種分離到相似的微生物，盡管它們不引起胸膜肺炎病變，但在形態(tài)、培養(yǎng)特性等方面均與ppo極相似。因此，就統(tǒng)稱為類胸膜肺炎微生物（Pleuropnemonia
Like
organisms，PPLO）。

1956．Edward
和Freundt
提出“霉形體”。

目前，在醫(yī)學(xué)上譯作“支原體”。在獸醫(yī)學(xué)上，譯為“霉形體”。

二、形態(tài)及染色

霉形體是原核細(xì)胞生物中最小的介于細(xì)菌和病毒之間的一類微生物，無(wú)細(xì)胞壁，具有可塑性，大小125-250nm，很少超過(guò)1.0μm。由于個(gè)體小，細(xì)胞膜又具有彈性，故往往能通過(guò)0.45μm濾膜，甚至還能通過(guò)比自己還小的濾器，G染色弱陰性，一般用姬姆薩染色（菌體呈淡紫色）。

霉形體最外層是細(xì)胞膜，由蛋白質(zhì)與脂質(zhì)組成的三層結(jié)構(gòu)。內(nèi)、外二層主要是蛋白質(zhì)，中間層為脂質(zhì)。在脂質(zhì)中固醇約占36%。凡能作用于固醇的物質(zhì)，如二性霉素B、皂素、毛地黃苷等能引起霉形體細(xì)胞膜的破壞而死亡。有的霉形體在細(xì)胞膜外還有一層由多聚糖構(gòu)成的莢膜，有毒性，是霉形體的一種致病因素。

霉形體以二分裂繁殖為主，也見出芽、分枝或由球體延伸成長(zhǎng)絲，然后分節(jié)段成為許多球狀或短桿狀的顆粒。

有的霉形體有一種特殊的頂端結(jié)構(gòu)，能使霉形體粘附在宿主上皮細(xì)胞表面。這與霉形體在粘膜上的定植和致病有關(guān)。有些霉形體能運(yùn)動(dòng)，在霉形體內(nèi)有許多微絲組織成網(wǎng)，和運(yùn)動(dòng)有關(guān)。在前進(jìn)方向微絲成束，向前突出。也有認(rèn)為頂端結(jié)構(gòu)在表面上呈交替粘附和釋放，造成霉形體在表面滑動(dòng)。

霉形體和其他原核生物一樣，基因組是一個(gè)環(huán)狀雙鏈DNA。分子量較小，只有大腸埃希菌的1/5，故其合成和代謝很有限。霉形體用普通染色不易著色，用Giemsa法染色著色很淺。革蘭染色陰性。

三、培養(yǎng)特性

1．幾種基質(zhì)

在人工培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，霉形體的營(yíng)養(yǎng)要求比一般細(xì)菌高。除無(wú)膽甾原體外，培養(yǎng)基中必須加入10%~20%人或動(dòng)物血清。

血清主要用于提供固醇和其他長(zhǎng)鏈脂肪酸，不但是細(xì)胞膜合成需要，且具穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用。為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，常加入青霉素、醋酸鉈、疊氮鈉等藥物。

霉形體一般在pH7.8~8.0間生長(zhǎng)，低于7.0則死亡。但溶脲脲原體最適的pH為6.0~6.5，因在培養(yǎng)時(shí)溶脲脲原體分解尿素產(chǎn)氨，可使培養(yǎng)基pH升高。當(dāng)培養(yǎng)基指示劑變色即需移種，否則將迅速死亡。霉形體一般為兼性厭氧，僅個(gè)別菌株專性厭氧。有氧條件生長(zhǎng)良好，在5％CO2和95％N2的環(huán)境中，生長(zhǎng)為佳。適宜溫度為36℃。霉形體生長(zhǎng)緩慢，在含1.4%瓊脂的固體培養(yǎng)基上孵育2~3d（有的需要2周）后才長(zhǎng)出低倍顯微鏡下可見的微小菌落（10-600um）。典型的菌落呈荷包蛋樣，核心較厚，向下長(zhǎng)入培養(yǎng)基，周邊為一層薄薄的透明顆粒區(qū)。有的整個(gè)菌落呈顆粒狀。肺炎霉形體的菌落較大，直徑100~150μm。溶脲脲原體的菌落最小，僅10~40μm，故曾稱“T”株(tinystrain)。霉形體的菌落小，宜在低倍鏡下觀察。

液體培養(yǎng)基：成份要求復(fù)雜，且生長(zhǎng)緩慢，一般都需要幾天，在液體培養(yǎng)基中霉形體的生長(zhǎng)量較少，且個(gè)體小，一般不易見到混濁，只有小顆粒沉于管底或混或者根本不變混濁。溶脲脲原體在生長(zhǎng)量最大時(shí)每ml不超過(guò)106~107個(gè)菌落形成單位（CFU），故液體清亮。霉形體在固體和液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)達(dá)高峰后，若繼續(xù)培養(yǎng)，則很快死亡。在低溫下可延長(zhǎng)存活時(shí)間。在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，只有加入一些基質(zhì)后，根據(jù)顏色變化來(lái)判斷有無(wú)霉形體生長(zhǎng)。加入的基質(zhì)一般有葡萄糖、精氨酸等，加入0.002%酚紅作為指示劑（四氮唑中不加入）。

霉形體在不同基質(zhì)中的生長(zhǎng)表現(xiàn)

基質(zhì) 指示劑培養(yǎng)基pH值顏色（培養(yǎng)基）霉形體生長(zhǎng)后pH變化顏色變化

葡萄糖酚紅
7.8
紅
7.8-6.8
紅-----黃

精氨酸酚紅
7.0
微紅
7.0-7.8
微紅—紅

尿素酚紅
6.5
黃
6.5-7.4
黃-----紅

四氮唑無(wú)
7.6
無(wú)色
7.6-6.8
無(wú)色-----紅

（TTC）

（某些霉形體能還原培養(yǎng)基中的TTC，形成重氮化合物）

根據(jù)霉形體對(duì)基質(zhì)的要求不同而選用不同的培養(yǎng)基，一般一種霉形體只分解葡萄糖或Arg、尿素，尿原體只分解尿素，不分解其它基質(zhì)，但亦有分解葡萄糖，Arg或二者均不分解的。

2．菌落特點(diǎn)：在固體培養(yǎng)基上，長(zhǎng)成油煎蛋狀或臍狀的菌落。中心生長(zhǎng)點(diǎn)色暗，周邊生長(zhǎng)點(diǎn)色淡，圓形，菌落很小，必須在顯微鏡下才能看清，一般為50-500um不等，尿原體菌落更少，10-200um。

中心生長(zhǎng)點(diǎn)是怎樣形成的呢？

接種于瓊脂表面的霉形體進(jìn)入瓊脂間隙，然后呈集團(tuán)狀生長(zhǎng)，一旦突出于瓊脂表面，則以較快的速度在瓊脂表面蔓延生長(zhǎng)，成為中心生長(zhǎng)點(diǎn)及周邊生長(zhǎng)區(qū)。

四、抵抗力

由于無(wú)細(xì)胞壁，所以對(duì)青霉素有抵抗力，此外對(duì)醋酸鉈（1/2000-1/8000）有抵抗力，故常用青霉素、醋酸鉈為抑菌劑來(lái)分離霉形體。青霉素主要作用于G+菌，醋酸鉈主要作用于霉菌及一些芽胞菌。

本菌對(duì)泰樂菌素、林肯霉素、鏈霉素、氟哌酸等敏感。

對(duì)外界環(huán)境的抵抗力很弱，對(duì)滲透壓敏感。

五、分布及致病性

自然界分布極為廣泛，各種家畜、家禽、小動(dòng)物、人類，陰溝污水，土壤等都存在有，其中許多能使人、畜禽致病。

常感染動(dòng)物呼吸道、泌尿生殖道、乳腺、眼、腹膜、關(guān)節(jié)滑液囊膜等。主要營(yíng)寄生生活，單獨(dú)感染癥狀輕微，當(dāng)細(xì)菌或病毒等繼發(fā)感染或受外界不利因素的作用，引起疾病。

疾病特點(diǎn)是潛伏期長(zhǎng)，呈慢性經(jīng)過(guò)，地方性流行。致病菌主要有豬肺炎霉形體，禽敗血霉形體、滑液囊霉形體，牛羊霉形體（牛肺疫、肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎）等。

如：人---原發(fā)性非典型肺炎（肺炎霉形體）

牛、山羊：傳染性胸膜肺炎豬：地方性肺炎（喘氣?。?/font>

雞：慢性呼吸道病（CRD）

植物中：也發(fā)現(xiàn)了大量的霉形體，如：柑桔的黃病、立枯病等以前認(rèn)為是病毒，現(xiàn)已確診為是霉形體引起的，水稻黃銹病等。有些病原體已經(jīng)分離出，有的在電鏡下看到了霉形體顆粒，稱為類霉形體微生物“MLOS”（現(xiàn)已改稱為植原體）。

國(guó)內(nèi)已經(jīng)觀察到了許多“MLOS”，但尚未分離出霉形體。從牛瘤胃分離到一類霉形體，嚴(yán)格厭氧稱為厭氧原體，美國(guó)從自燃過(guò)的煤中分離到一類霉形體，能耐熱（56℃），耐低pH1-2，稱為熱原體。

六、分類

原核生物門軟皮體綱。1972，1979年頒布建議描述軟皮體綱內(nèi)新種的最低標(biāo)準(zhǔn)。1995，ISTM再次提出了最新的分類標(biāo)準(zhǔn)的建議。

原來(lái)軟皮體綱僅有1目。最近國(guó)際細(xì)菌系統(tǒng)分類委員會(huì)---軟皮體分類分會(huì)（ICSB-ISTM）對(duì)軟皮體綱內(nèi)的霉形體進(jìn)行了重新分類。

[可參閱：修正的描述軟皮體綱內(nèi)新種的最低標(biāo)準(zhǔn)]。

目前軟皮體綱內(nèi)有4目，5科，8屬共158個(gè)成員。

熱原體（thermoplasma）分類位置未定。其分類命名如下：

霉形體目---霉形體科---霉形體屬、尿原體屬

昆蟲形體目---昆蟲形體科---昆蟲形體屬、中間形體屬

---螺旋形體科---螺旋形體屬

無(wú)膽甾形體目---無(wú)膽甾形體科---無(wú)膽甾形體屬

厭氧形體目---厭氧形體科---厭氧形體屬、無(wú)膽甾厭氧形體屬

分類的依據(jù)

1．綱：此綱微生物的主要特征---①缺乏細(xì)胞壁，②在固體培養(yǎng)基上形成油煎蛋狀菌落，③能通過(guò)200-450nm的細(xì)菌濾器，④基因組富含AT，⑤在適宜的條件下，無(wú)細(xì)胞壁的菌株不能回復(fù)為具有細(xì)胞壁的細(xì)菌。

2．目、科、屬的分類是依據(jù)形態(tài)學(xué)、宿主來(lái)源、最適生長(zhǎng)溫度、培養(yǎng)特性及生化特性。

七、
細(xì)生物學(xué)

1．
細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

① 細(xì)胞膜
單位膜（單層細(xì)胞膜）

在結(jié)構(gòu)上與一般動(dòng)物細(xì)胞膜差別不大，均為三層結(jié)構(gòu)，中層為脂質(zhì)層，又稱為電子透明層（因電子致病度稀?。?，形成兩暗夾一明的結(jié)構(gòu)。

化學(xué)成分：蛋白質(zhì)、脂、糖等，是細(xì)胞生物學(xué)研究生物膜的最好材料。

（原因：a膽固醇含量
b類胡蘿卜素）

② 遺傳物質(zhì)：核酸（RNA，DNA）游離于細(xì)胞質(zhì)或附于細(xì)胞膜上。加：DNA：雙股環(huán)狀?；蚪M大小為5×108道爾頓，所含的遺傳信息量要比細(xì)菌少得多，是大腸桿菌的1/5，是原核生物中最小的DNA.G+C含量為23%-30%左右，也比細(xì)菌低。

從進(jìn)化論角度看，越原始，G+C%含量就越低。越進(jìn)化，G+C%含量就越高。

③ 核糖體位于膜及細(xì)胞質(zhì)中。

④ 酶系統(tǒng)：ATP酶、脫氫酶。

2．繁殖：一般二等分裂----（出芽、絲狀斷裂等）。一般認(rèn)為小球狀細(xì)胞是霉形體增殖的基礎(chǔ)，也稱為最小繁殖單體。

3．霉形體與其它原核生物的關(guān)系：

霉形體也是一種原核生物，但與細(xì)菌、立克次氏體、衣原體及其它微生物明顯不同。如：細(xì)菌，三層結(jié)構(gòu)的單位膜，70s核糖衣體，典型的環(huán)狀染色體。

但霉形體是目前已知能生活在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上的最小的微生物。由于缺乏細(xì)胞壁，就決定了它們特征的菌落形態(tài)，濾過(guò)性染色特征，生長(zhǎng)能被特異性抗體抑制，對(duì)多種抗菌素有抵抗力等。

目前，有兩種假設(shè)來(lái)解釋霉形體與其它微生物的關(guān)系：一種假設(shè)是霉形體是一類真正的生物，是通過(guò)生物進(jìn)化演變而來(lái)；另一種假設(shè)是霉形體來(lái)源于細(xì)菌，細(xì)菌脫去細(xì)胞壁后發(fā)生了不可逆變異。

霉形體與細(xì)菌L型形態(tài)極為相似，都沒有細(xì)胞壁，形體柔軟，形態(tài)多樣，都能通過(guò)細(xì)菌濾器，對(duì)作用于細(xì)胞壁的抗菌素有抵抗力。那么，如何區(qū)別霉形體與細(xì)菌L型？（從7個(gè)方面加以區(qū)別）。

霉形體與細(xì)菌L型的區(qū)別

形態(tài)	霉形體	細(xì)菌L型
形態(tài)	固有生命形態(tài)	細(xì)菌變異形態(tài)
無(wú)抗生素培養(yǎng)基	恒定、保持固有形態(tài)	可恢復(fù)原來(lái)細(xì)菌形態(tài)
對(duì)甾醇的需要	除不需甾醇科外，均需甾醇	一般不需要
DNA中G+C%	含量比細(xì)菌低	含量高，與細(xì)菌相同
對(duì)洋地黃皂苷的作用	敏感	有抵抗性
抗體抑制試驗(yàn)	能抑制生長(zhǎng)	無(wú)抑制作用
菌落	光亮、透明、中心深埋于培養(yǎng)基中	較暗，不透明，生長(zhǎng)于基質(zhì)表面，易于刮割
狄乃氏菌落染色	明顯著色，不退色	著色淺、迅速退色

八、霉形體的分離和鑒定

培養(yǎng)方法：人工培養(yǎng)基，雞胚接種，攻毒(本動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)

1、取材：無(wú)菌采取呼吸道、泌尿生殖道材料或乳汁、關(guān)節(jié)液、淋

巴結(jié)等作檢查。

組織塊、分泌物、液體（乳汁、關(guān)節(jié)液）、淋巴結(jié)等立即接種：① 生長(zhǎng)培養(yǎng)基。② 不能立即接種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，應(yīng)先接種運(yùn)輸培養(yǎng)基（注：應(yīng)將液體培養(yǎng)基中的醋酸鉈去掉，因?yàn)榇姿徙B可以抑制尿原體生長(zhǎng)）。

2、培養(yǎng)基：不同霉形體其成分不一樣。

（1）PPLO肉湯。

（2）血清：常用的是馬血清和豬血清，馬血清不滅活，豬血清滅活。

（3）酵母浸出汁或自溶物：提供促生長(zhǎng)因子（主要是Vit B族—輔基、輔酶的主要成分。

（4）抑菌劑：青霉素1000u/ml
醋酸鉈1/4000

（5）基質(zhì)：葡萄糖、Arg、尿素或四氮唑。

（6）特殊需要：NAD（輔酶I）煙酰胺鳥嘌呤二核基酸。

3、pH 7.6-7.8

4、氣體及溫度、濕度

CO2，37℃（霉形體，尿原體），25℃（無(wú)膽甾原體）

5、霉形體在不同基質(zhì)中的生長(zhǎng)表現(xiàn)（見前面相關(guān)內(nèi)容）

6、各種培養(yǎng)基形式

按基質(zhì)不同可分為：葡萄糖培養(yǎng)基
Arg培養(yǎng)基

尿素培養(yǎng)基四氮唑培養(yǎng)基

按作用不同可分：分離培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)基

保存培養(yǎng)基運(yùn)輸培養(yǎng)基

按培養(yǎng)基形式不同：液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基

半固體培養(yǎng)基雙相培養(yǎng)基

7、幾種常用的培養(yǎng)基

①
馬丁肉湯（瓊脂）（牛、羊）

②
FM-4培養(yǎng)基（固體和液體）（禽類）

③
Goodwin
Frii`s 培養(yǎng)基（豬）

④Edward 培養(yǎng)基

⑤Hayflick培養(yǎng)基
⑥尿原體培養(yǎng)基

九、霉形體的鑒定主要是通過(guò)血清學(xué)及生化特性來(lái)鑒定。

按照國(guó)際細(xì)菌分類委員會(huì)霉形體分委會(huì)的規(guī)定，種的鑒定血清學(xué)方法包括生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)（GI），代謝抑制試驗(yàn)（MI）和表面免疫熒光法（epi-IMF）或瓊脂平板免疫熒光法。

1、生長(zhǎng)抑制試驗(yàn) 在軟皮體綱新種的血清學(xué)特性鑒定中，生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)是最有用的技術(shù)。

依據(jù)是加入抗血清的固體培養(yǎng)基可以抑制相應(yīng)霉形體的生長(zhǎng)。

2、代謝抑制試驗(yàn)：原理是基于抗血清能抑制相應(yīng)霉形體某些代謝活性（如：葡萄糖發(fā)酵、精氨酸水解或尿素分解等），其抑制活性是以阻止pH值變化來(lái)顯示的。

3、表面免疫熒光法（瓊脂平板免疫熒光法）：直接熒光法和間接熒光法。原理: 生長(zhǎng)在瓊脂平板上的霉形體菌落表面菌體抗原或分與同源抗體

反應(yīng)，再與熒光標(biāo)記的抗抗體結(jié)合后，在落射式熒光顯微鏡下可觀察到菌落熒光。

國(guó)內(nèi)畢丁仁（1986）首次用直接表面免疫熒光法對(duì)禽源霉形體進(jìn)行了鑒定。

十、生化特性：根據(jù)對(duì)糖類分解能力，分為兩群。一群能分解多種糖類產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，稱發(fā)酵型；另一群不能分解糖，稱為非發(fā)酵型，但能利用精氨酸作為碳素和能量來(lái)源。

某些菌株在含血液的培養(yǎng)基中其菌落周圍可形成β型或α型溶血。

禽敗血霉形體、肺炎霉形體的菌落能吸附禽類紅細(xì)胞。

1、葡萄糖發(fā)酵：是在需氧和厭氧兩種培養(yǎng)條件下估價(jià)該霉形體分解葡萄糖產(chǎn)酸的能力。

2、精氨酸水解：產(chǎn)生氨而使pH值升高。

3、β-D-葡萄糖苷酶的檢測(cè)

各種無(wú)膽甾原體的β-D-葡萄糖苷酶水平可能是區(qū)分種的有效方法。

對(duì)該酶的檢測(cè)是以七葉苷或楊梅苷的水解為基礎(chǔ)。

第二節(jié)
豬的霉形體

從豬體內(nèi)已分離到近二十多種霉形體，有一部分是非致病性的，有些是致病性的。主要是豬肺炎霉形體、豬鼻霉形體、豬滑液霉形體、絮狀霉形體、顆粒無(wú)膽甾原體等，確認(rèn)有病原性主要有三種（前三種）。

一、豬肺炎霉形體---引起喘氣病（豬地方流行性肺炎）

在豬肺炎中起主要作用，屠宰豬，肺炎病高達(dá)30-60%，其中絕大多數(shù)是由于豬肺炎霉形體引起。主要引起的經(jīng)濟(jì)損失是飼料報(bào)酬降低，成本增高，因而每年養(yǎng)豬場(chǎng)所引起的損失是相當(dāng)巨大的。

（一）形態(tài)

多形態(tài)，如環(huán)狀、燈泡狀、球狀、兩極桿菌狀等，0.2-0.4um左右，常有幾個(gè)集聚成團(tuán)。

（二）培養(yǎng)

營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，兼性厭氧，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求更高，因而一直未分離到病原，直到1965年國(guó)外才分離成功（主要是美國(guó)和丹麥的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)分離到，我國(guó)是1973年由上海所最先分離到）。

1、肉湯：酵解葡萄糖產(chǎn)酸，用酚紅作指示劑pH從7.8-6.8，顏色由紅變黃，表明可能有霉形體生長(zhǎng)，一般需3-5天，但接種量大時(shí)，可縮短變色時(shí)間，接種量少時(shí)變色延長(zhǎng)，有時(shí)可能達(dá)20天以上。

2、固體培養(yǎng)基：在A26的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2-10d可長(zhǎng)成直徑25-100um的菌落，但不呈“煎荷包蛋狀”。一般不顯示中心臍狀，表面呈顆粒狀。培養(yǎng)環(huán)境要濕潤(rùn)，需要加5-10% CO2。

（三）抵抗力對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較弱，存活一般不超過(guò)26h。病原體在-15℃可保存45d，在甘油中0℃可保存8個(gè)月。經(jīng)冷凍干燥的培養(yǎng)物在4℃可存活4年。

對(duì)常用化學(xué)消毒劑敏感。對(duì)泰樂菌素、螺旋霉素、林可霉素敏感；青霉素、鏈霉素、紅霉素和磺胺對(duì)其無(wú)效。

（四）致病性：能引起豬喘氣?。?/font>Enzootic Pneumoniae of pigs，Epp）。

僅感染豬，引起豬地方流行性肺炎。幼豬最為易感。不良的環(huán)境因素和繼發(fā)感染，常使病情加劇。

經(jīng)呼吸道直接接觸傳播，多呈慢性經(jīng)過(guò)，主要癥狀為咳嗽、喘氣、患病豬肺中含有很高量的感染粒子，一般每克肺含107個(gè)感染劑量，但在野外條件下，大多數(shù)感染豬呈不顯臨床癥狀的隱性感染。只是在屠宰時(shí)可見有心葉、尖葉、膈葉前沿呈膠樣變。病肺組織致病性很強(qiáng)，但一經(jīng)在培養(yǎng)基中傳代幾次（可能10次）即失去致病能力。但回歸豬后，毒力可返強(qiáng)（只需2-3代）。

（五）微生物學(xué)診斷

一般根據(jù)臨床癥狀、病理刻檢，結(jié)合流行病學(xué)即可確診。x光檢查具有重要診斷價(jià)值。必要時(shí)可進(jìn)行微生物學(xué)診斷。

1、取材：病肺組織或呼吸道分泌物。

可以直接用病肺組織與健康組織交界處作觸片，然后用姬姆薩染色觀察菌體。

2、分離培養(yǎng)：要注意以下幾個(gè)問(wèn)題。

① 所用器材、試劑必須與組織培養(yǎng)要求一樣。

② 用液體培養(yǎng)基分離（因?yàn)榈侥壳盀橹梗€沒有發(fā)現(xiàn)哪一個(gè)實(shí)驗(yàn)是用固體培養(yǎng)基分離到這種霉形體）。

③ 要采取抑制豬鼻霉形體生長(zhǎng)的措施。因?yàn)樨i呼吸道的豬鼻霉形體很普通，也很容易生長(zhǎng)。一旦混有豬鼻霉形體，由于快速生長(zhǎng)將掩蓋豬肺炎霉形體的生長(zhǎng)。可以采取以下幾種方法來(lái)抑制豬鼻霉形體的生長(zhǎng)：

a：加豬鼻霉形體的抗血清。

b：向培養(yǎng)基中加抗菌素如硫酸卡那霉素或環(huán)絲氨酸，對(duì)豬鼻霉形體有選擇性的抑制作用。

c：將血清濃度提高至適合豬肺炎霉形體生長(zhǎng)而不適合豬鼻霉形體生長(zhǎng)的范圍（如27%）。

④ 即使有了合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)技術(shù)，也不是完全有把握能分離到豬肺炎霉形體。

分離方法：用Frii`s培養(yǎng)基或Goodwin氏培養(yǎng)基。

病料采集、處理、洗滌、碾碎、用培養(yǎng)液稀釋。10倍稀釋至10-5或10-8，37℃培養(yǎng)。也可能高稀釋度生長(zhǎng)而低稀釋度反而不生長(zhǎng)。

可能需要盲目傳代，傳代適應(yīng)后可接入固體培養(yǎng)基，分離到以后用GI、MI或IMF法進(jìn)行鑒定。

3、動(dòng)物接種：可用敏感的小豬接種，用病料經(jīng)呼吸道（肺、氣管、鼻腔）接種。

4、血清學(xué)診斷：間接血凝感染率從20-80%不等。

ELISA
檢查群體感染水平凈化

（六）免疫

病愈后有免疫力，但還可帶菌，即所謂傳染性免疫。體內(nèi)有菌時(shí)，可以抵抗再感染，一旦無(wú)菌則無(wú)抵抗力。

康復(fù)豬具有較堅(jiān)強(qiáng)的免疫力。中監(jiān)所通過(guò)近20多年努力已制成了疫苗，保護(hù)率達(dá)70%以上。

（七）凈化（豬喘氣病的凈化）

凈化對(duì)象：1、并發(fā)其他細(xì)菌感染的喘氣病豬群；2、在SPF豬場(chǎng)中喘氣病豬群。

凈化措施：1、要選取大于10月齡的后備母豬，最好選擇經(jīng)產(chǎn)母豬且至少選取后10天不出現(xiàn)分娩者；2、全群每天投給相應(yīng)的抗生素，如將泰妙靈（6mg/kg體重）拌入飲水中，配制相當(dāng)于100-200ppm的濃度；3、將所有的豬舍和豬欄徹底沖洗和消毒，在凈化期間，應(yīng)持續(xù)一年監(jiān)控。（臨床觀察、血清學(xué)檢測(cè)、初乳檢樣、接觸感染試驗(yàn)）。

二、豬滑液霉形體

1、形態(tài)特征：與豬肺炎霉形體類似，0.3-0.6um，球狀。

2、培養(yǎng)：在肉湯培養(yǎng)中能形成顆粒狀沉淀，生長(zhǎng)能被豬胃粘蛋白或酵母自溶物刺激，水解精氨酸，不酵解葡萄糖，固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型的油煎蛋狀外觀。

3、抵抗力：較弱，在蓋玻片上干燥后30天還存活。

4、病原性：主要是關(guān)節(jié)炎，3-6月齡易感，瘦肉豬更敏感，通常突然發(fā)病，急性跛行，持續(xù)3-10天，大多數(shù)都逐漸恢復(fù)，有些豬跛行漸重，不能站立，一般為非化膿性關(guān)節(jié)炎，涉及到跗關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)和肘關(guān)節(jié)，有些關(guān)節(jié)由于肌肉豐滿而未發(fā)現(xiàn)，感染關(guān)節(jié)內(nèi)有淡黃色液體，有些是纖維素性，滑膜增重。

流行特征：a. 年齡：3-6月齡；b. 瘦肉型豬；c. 伴隨引種而爆發(fā)；d.發(fā)病率高，可達(dá)30-80%不等；e. 典型的臨床特征是跛行，大多能恢復(fù)；f.成年豬隱性帶菌很普通。

5、微生物學(xué)診斷

分離: 急性期，即發(fā)病的前7天，從忠病關(guān)節(jié)中分離到豬滑液霉形體，在精氨酸肉湯中產(chǎn)堿，葡萄糖不產(chǎn)酸，能被豬胃粘蛋白刺激生長(zhǎng)，菌落呈油煎蛋狀，血清學(xué)鑒定主要用GI、MI等。

三、絮狀霉形體

比豬肺炎霉形體更難分離，營(yíng)養(yǎng)要求更高，自病變肺可分離到，但病原性很輕微，重要的是這種霉形體與豬肺炎霉形體有共同抗原。

四、豬鼻霉形體：仔豬呼吸道特別是鼻腔的正常寄居菌，也能從患喘氣病豬中分離到，但一般認(rèn)為是繼發(fā)入侵者，能使葡萄糖培養(yǎng)基迅速產(chǎn)酸。

致病性：

1、正常情況下并不引起任何臨床癥狀，但有小部分幼豬可引起漿膜炎，病程約10-14天后恢復(fù)，死亡率低。但胸膜、心包膜和腹膜粘連以及可發(fā)生關(guān)節(jié)炎，實(shí)驗(yàn)接種可引起多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎以及輕微的致肺炎作用。

2、世界范圍的組織細(xì)胞的污染問(wèn)題。

五、顆粒無(wú)膽甾原體：為豬鼻腔的正常寄居菌，無(wú)病原性。

第三節(jié) 禽霉形體

目前，從禽類共分離到25種霉形體，其中霉形體21種，無(wú)膽甾原體3種，尿原體1種，最重要的有三個(gè)成員是：雞毒霉形體（MG）、滑液霉形體（M.S）和火雞霉形體（MM）。有的將此三種霉形體稱為致死性霉形體，此外還有衣阿華霉形體。

一、雞毒霉形體（Mycoplasma gallisepticum .MG）

又名禽敗血霉形體，是引起雞和火雞等多種禽類慢性呼吸道病(CRD)或火雞傳染性竇炎的病原。

（雞）臨床癥狀：以呼吸羅音、咳嗽、鼻漏為特征?；痣u：常見竇炎。

1、形態(tài)：球形，直徑250-500nm，G-，姬姆薩染色著色良好。

2、培養(yǎng)：需氧和兼性厭氧，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高。

最常用的是修改的FM-4培養(yǎng)基（其中加有青霉素、醋酸鉈）最適pH：7.8，T：37-38℃。

在含馬血清或滅活雞、豬血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，一般常用牛心浸出液培養(yǎng)基，用前加入10％-20％馬血清，為了抑制雜菌的生長(zhǎng)需加入醋酸鉈(1：4000倍)和青霉素1000IU/mL，調(diào)pH 7.8-8.0。

在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-7天可觀察到菌落，呈典型油煎蛋狀外觀，能凝集雞和火雞的紅細(xì)胞。

在液體培養(yǎng)基中，37℃經(jīng)2-5d可呈現(xiàn)輕度渾濁，在固體培養(yǎng)基上經(jīng)3-10d，可形成圓形露滴樣小菌落，直徑約0.2-0.3mm。

在5-7d齡雞胚卵黃囊內(nèi)繁殖良好，并可使雞胚在接種后5-7d內(nèi)死亡。

3、生化：能發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

4、抵抗力：不強(qiáng)。

對(duì)理化因素的抵抗力不強(qiáng)，一般的化學(xué)消毒劑均能將其殺滅。在肉湯培養(yǎng)物中-30℃能存活2-4年，凍干后在-4℃能存活7年。在卵黃中37℃能存活8周，在孵化的雞胚中45.6℃經(jīng)12-24h可被滅活。對(duì)青霉素和醋酸鉈有抵抗力，對(duì)泰樂菌素、紅霉素等敏感。

5、致病性：

本菌主要感染雞和火雞，引起CRD。病原體存在于病雞和帶菌雞的呼吸道、卵巢、輸卵管和公雞精液中，帶菌雞胚可垂直傳遞給后代。

應(yīng)激因子可協(xié)同作用，使病情惡化、癥狀明顯。大腸桿菌特別是O78、O2、Ol株繼發(fā)感染。

常見竇炎、氣管炎、氣囊炎。

成年雞群：最具有特征的自然發(fā)病癥狀是氣管羅音、流鼻涕、咳嗽和氣囊炎、食量減少、體重減輕。

產(chǎn)蛋雞群：可使產(chǎn)蛋率下降10-40%，種蛋孵化率下降10-21%，角膜結(jié)膜炎（Nunoya等報(bào)道）。

肉用仔雞群：癥狀通常比成年雞群中觀察到的明顯疾病爆發(fā)大多在4-8周齡。生長(zhǎng)明顯受阻，體重減少38%，飼養(yǎng)期延長(zhǎng)，飼料轉(zhuǎn)化率降低21%。

本病一年四季均可發(fā)生，以寒冷季節(jié)較為嚴(yán)重。

火雞感染主要表現(xiàn)為竇炎、竇部腫脹、少數(shù)病例不出現(xiàn)竇炎，以嚴(yán)重的下呼吸道癥狀為主。

其它的致病微生物（如NDV、IBV、E.coli等）與MG并發(fā)感染常導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重程度增加和病期延長(zhǎng)。

無(wú)并發(fā)癥，死亡率低，有并發(fā)癥可達(dá)30%。

6、微生物學(xué)診斷

分離不易，主要靠血清學(xué)試驗(yàn)快速診斷。

血清學(xué)診斷常用平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)等。抽樣檢查，檢出抗體陽(yáng)性雞，判為陽(yáng)性雞群。

① 分離病原

取材：氣管或氣囊的滲出液、鼻甲骨、肺的懸浮液或鼻竇的滲出液。

分離培養(yǎng)：一般來(lái)說(shuō)，一份病料同時(shí)接種液體和固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離，有助于提高分離率。

接液體培養(yǎng)基后應(yīng)隔日盲目傳代一次，（以免細(xì)菌的快速生長(zhǎng)而掩蓋霉形體的分離，固體培養(yǎng)基至少應(yīng)在37℃培養(yǎng)5-7天確認(rèn)無(wú)霉形體菌落生長(zhǎng)才能判為陰性而丟棄。

②血清學(xué)診斷

常規(guī)：血清平板凝集試驗(yàn)
SPA

血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)

種的鑒定：GI、MI、IMF，
Dot-ELISA（1989），
ELISA（1985）May。

7、免疫防制：弱毒苗滅活苗

對(duì)鏈霉素、土霉素、紅霉素、螺旋霉素、泰樂菌素、林肯霉素敏感。

發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)雞毒霉形體病十分重視。如：美國(guó)“全國(guó)家禽改進(jìn)計(jì)劃”中規(guī)定的MG控制方案要求，作為正常的無(wú)MG雞群的子代群，在大于4月齡時(shí)必須對(duì)全群中至少10%的雞（不少于300只）進(jìn)行血液檢查，其血清學(xué)檢查MG為陰性，則證實(shí)無(wú)MG感染。隨后在不超過(guò)90天的時(shí)間內(nèi)，對(duì)雞群至少隨機(jī)抽樣150只進(jìn)行血清學(xué)檢查，陽(yáng)性者不留作種用。

二、滑液囊霉形體（M.Synoviae MS）

致雞和火雞傳染性滑液囊炎，并可通過(guò)蛋傳播。營(yíng)養(yǎng)要求更高。

1、形態(tài)和染色：與MG相似，直徑為200-400mm，在姬姆薩染色片中表現(xiàn)為多形態(tài)的球狀體。

2、生長(zhǎng)需要：

① 需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，輔酶I）。

② 必須要血清才能生長(zhǎng)，豬血清較好（10%）

最適生長(zhǎng)溫度為37℃。

瓊脂上的生長(zhǎng)可通過(guò)將平板置于密封的罐中來(lái)完成，這樣就可以避免瓊脂干燥。

3、生化特性：能發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

有些菌株可凝集雞或火雞的紅細(xì)胞。

4、微生物學(xué)診斷

① 分離鑒定：采取急性病雞的關(guān)節(jié)滲出液、肝、脾等材料，分離培養(yǎng)。菌落壓片用熒光抗體、酶標(biāo)抗體檢查鑒定。

培養(yǎng)基
FM-4（加NAD）

② 血清學(xué)檢查：血清平板凝集試驗(yàn)

第四節(jié) 牛霉形體

牛霉形體在霉形體研究歷史上具有特殊的位置。Nocard（1898）所培養(yǎng)的霉形體就是被人們所認(rèn)識(shí)的第一個(gè)霉形體，這種霉形體被稱為絲狀霉形體絲狀亞種（Myaplasna Mycoides Subsp myeoides）。

目前已從牛分離到近20多種霉形體。

1、
病原性：是牛傳染性胸膜肺炎（CBPP）的病原菌，是牛的僅次

于牛瘟的傳染病。病變特征是間質(zhì)性、纖維素性肺炎、肺水腫、間質(zhì)增寬，病原存在于肺、縱膈淋巴、胸腔滲出液中，隨氣管，鼻腔排出體外，此病廣泛存在并流行，但亞洲只有部分地區(qū)有報(bào)道。近幾十年來(lái)該病在歐洲的一些地區(qū)亦存在（在歐洲南部有CBPP流行）。目前，很多學(xué)者認(rèn)為CBPP的存在狀況在歐洲和非洲區(qū)別很大，在歐洲，CBPP構(gòu)成的死亡率很低。甚至比因?yàn)榄h(huán)境氣候變化，飼養(yǎng)管理不當(dāng)引起的損失還小。

《國(guó)外獸醫(yī)學(xué)---畜禽傳染病》P5.1P47-48《牛傳染性胸膜肺炎在歐洲

的流行和研究現(xiàn)狀》。

我國(guó)解放前及解放初期有流行，目前沒有確切的病例報(bào)告。

2、生物學(xué)特性：利用葡萄糖，不利用精氨酸和尿素。菌體呈多形態(tài)，菌落呈典型的油煎蛋狀外觀，有大菌落型（LC）及小菌落型（SC）兩種類型。小菌落型對(duì)牛的毒力很強(qiáng)，對(duì)羊毒力很弱，大菌落型相反。LC型與SC型血清學(xué)上不易區(qū)分。

3、診斷牛肉湯+馬血清

① 分離用馬丁肉湯加血清或者用胃肝湯加血清

② 病原鑒定：用GI、 MI、 IMF

③ 血清學(xué)診斷：a：用補(bǔ)反（CFT）；b：聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）---檢測(cè)剖檢牛的肺樣和胸腔積液的特異性DNA；c：免疫斑點(diǎn)技術(shù)（一種ELISA法），但任何單一的方法不可能確切地檢出CBPP，只有將上述的方法有效地結(jié)合使用才確保診斷的可靠性和準(zhǔn)確性。

4、免疫

用弱毒菌苗牛的兔化弱毒苗效果很好

我國(guó)已基本上消滅了此病，但近年來(lái)我國(guó)有些地區(qū)（如云南、新疆、西藏等）可能有發(fā)生。

二、牛霉形體

從爆發(fā)牛乳房炎牛群中分離到，是引起奶牛乳房炎，致泌乳銳減的病原菌，在感染群中，從非乳房炎牛中也能分離到。

1、特性：利用葡萄糖，不利用精氨酸和尿素，從病料中分離很容易。

2、致病性：致牛的乳房炎，乳汁中滴度很高達(dá)106-107。致病力很強(qiáng)，僅用70個(gè)CFU就能引起乳房炎。

三、其它霉形體：牛生殖道霉形體牛鼻霉形體眼霉形體

加拿大霉形體尿原體

第五節(jié) 羊霉形體

一、絲狀霉形體絲狀亞種（M.mycoides
subsp
mycoides）

絲狀霉形體山羊亞種（M.mycoides
subsp.capri）