幾種蛋白原料的體外消化率的測定方法的比較

楊紅艷

摘 要 試驗分別采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步法、肉食性魚類（如鱸魚）消化道粗酶提取液消化法和草食性魚類（如草魚）消化道粗酶提取液消化法測定了酪蛋白、魚粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉等7種蛋白質(zhì)原料的體外消化率。3種測定方法中，魚粉的消化率差異不顯著（P＞0.05）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉用兩步法和草魚消化酶法測定的消化率無顯著差異（P＞0.05）；棉籽粕消化率用兩步法測定值高于用消化酶法的測定值，差異極顯著（P＜0.01）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉的消化率用兩步法比用鱸魚消化酶測定的值高，差異極顯著（P＜0.01）；草魚消化酶法和鱸魚消化酶法對酪蛋白的消化率無顯著差異（P＞0.05），而對于豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉草魚消化酶法測定值高于鱸魚消化酶法的測定值，差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步體外消化法在測定魚粉蛋白質(zhì)消化率時可以替代魚類消化液粗酶消化法，對于其它蛋白質(zhì)原料使用該方法應(yīng)慎重。
關(guān)鍵詞 蛋白質(zhì)飼料；體外消化率；測定方法中圖分類號 S816.32

　　消化率是動物從食物中所消化吸收的部分占總攝入量的百分比，是評價飼料營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)之一。測定飼料消化率主要有兩種方法：體外法和體內(nèi)法。體內(nèi)法測定的消化率能夠比較真實的反映魚類對飼料的消化情況。但體內(nèi)法測定方法復(fù)雜、時間長、費用高，而且對外界環(huán)境的要求較高，季節(jié)、溫度、光照等都會影響消化率測定值。體外消化法是利用精制的消化酶或研究對象的消化道酶提取液在試管內(nèi)進(jìn)行的消化試驗，其測定值可近似反映魚對飼料的消化率。此法能快速測定原料的相對利用率，為營養(yǎng)師制作配方提供參考[1]。然而，體外消化法無法反映體內(nèi)消化的真實情況。Boisen 和Eggum（1991）在胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步法中利用標(biāo)準(zhǔn)過濾裝置測得飼料蛋白質(zhì)消化率與鼠和豬的真消化率十分接近，他們認(rèn)為這種方法測得的蛋白質(zhì)體外消化率經(jīng)內(nèi)源氮校正與回腸末端蛋白質(zhì)表觀消化率高度相關(guān)。我國飼料原料品種多，營養(yǎng)成分含量差異大，加工方式各異，飼料原料對不同魚類的營養(yǎng)價值差異更大。由于魚類生活在水中，測定魚類飼料真消化率比測定畜禽的更加困難。所以尋找一種準(zhǔn)確、簡便、實用的消化率測定方法對評價魚類飼料的消化率有著十分重要的意義。本試驗采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步體外消化法以及從肉食性和草食性魚類的消化道提取消化酶在體外消化飼料的方法，測定了7種常用蛋白質(zhì)飼料原料的消化率，為飼料生產(chǎn)者配制魚用飼料提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時為體外測定魚用蛋白質(zhì)原料消化率提供參照。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 飼料原料
酪蛋白、魚粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉，均為經(jīng)105℃烘干處理的樣品，粉碎過60目篩后保存?zhèn)溆谩?br /> 1.1.2 主要試劑
硫酸（GB  625—77）、硫酸銅（GB  665—78）、硫酸鉀（HG 3—920—76）和氫氧化鈉（GB 629—77），均為分析純。
硼酸（GB 628-78）（分析純）：2g溶于100ml水配成2%溶液（W/V）。
混合指示劑：甲基紅（HG 3—958—76）0.1%乙醇溶液，溴甲酚綠（HG 3—1220—79）0.5%乙醇溶液，兩溶液等體積混合，陰涼處保存期三個月以內(nèi)。
0.05mol/l HCl溶液：取4.2ml濃鹽酸，用蒸餾水定容至1L。
標(biāo)定甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑：取20 ml 0.1%甲基紅酒精溶液，與20ml 0.5%溴甲酚綠酒精溶液，混勻。
胃蛋白酶活性為1：10 000；胰蛋白復(fù)合酶活性為2 500IU/mg；鱸魚消化道混合液；草魚消化道混合液；雙抗為青霉素G鉀鹽（150 IU/ml）和硫酸鏈霉素（150IU/ml）；14%磺基水楊酸鈉。
1.1.3 主要儀器
實驗用樣品粉碎機、分析篩（孔徑0.60mm）、分析天平（感量0.001g）、滴定管（酸式，100ml）、電爐、消化爐、電熱式恒溫烘箱、干燥器、凱氏蒸餾裝置、過濾裝置、磁力攪拌器、離心機、恒溫水浴振蕩器等。
1.2 試驗方法
     1.2.1 原料蛋白質(zhì)測定
     1.2.1.1 消化
稱取0.6～0.7g（準(zhǔn)確至0.001g）試樣，無損失地放入消化瓶中，加入無水硫酸鈉和硫酸銅的混合物[m（CuSO4·5H2O)：m(Na2SO4)=1：9]6g，與試樣混合均勻，再加濃硫酸20ml，在消化爐上小心加熱，起初電壓調(diào)大，冒煙時調(diào)小電壓，大量冒煙后再調(diào)大電壓，加熱至樣品呈透明的淺藍(lán)色或白色為止，關(guān)上電源，使消化瓶自然冷卻。而后，用蒸餾水沖洗消化瓶，洗液注入100ml容量瓶內(nèi)，定容。同時做一個空白對照試驗。
     1.2.1.2 蒸餾
連接好凱氏蒸餾裝置，加熱使之產(chǎn)生蒸汽。取20%硼酸溶液20ml置于150ml三角瓶內(nèi)，并加混合指示劑1滴，然后將其置于冷凝管下。吸取消化稀釋液10ml，由漏斗處加入反應(yīng)室內(nèi)，再加40% NaOH溶液10ml。使蒸汽進(jìn)入反應(yīng)室，加熱蒸餾，直至三角瓶內(nèi)硼酸溶液增加1倍體積，移開三角瓶，停止加熱。將空白對照的消化液做同樣處理。
     1.2.1.3 滴定
用0.05 mol/l鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，到接收液由綠色變?yōu)榛壹t色即是終點。同樣滴定空白實驗的接收液。
     1.2.1.4 計算

式中：CB——含氮量；
        NHCl——滴定所用鹽酸的濃度；
        V1——試樣滴定時所需酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）；
        V2——空白滴定時所需酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）；
        m——試樣的質(zhì)量（g）。
   1.2.2 消化液測定法
     1.2.2.1 胃蛋白酶最適量的選擇
分別取0.5g豆粕置于3個三角瓶中，各加入含不同胃蛋白酶活性單位（100IU、160IU、200IU）的pH值為1.4的0.05mol/l HCl-KCl緩沖液30ml，在40℃臺式恒溫?fù)u床上保溫3h后過濾，多次沖洗殘留物，用凱氏定氮法測定殘留物的蛋白質(zhì)含量。計算飼料蛋白質(zhì)消化率，確定出胃蛋白酶的最適用量為160 IU（表1）。

1.2.2.2 胰蛋白酶最適用量的選擇
分別取0.5g豆粕置于3個三角瓶中，用含有胃蛋白酶濃度為0.05mol/l的HCl-KCl緩沖液做前處理，之后加0.2mol/l的氫氧化鈉溶液處理消化液使之pH值等于6.8。再分別加入含不同胰蛋白酶活性（100IU、150IU、200IU）的0.05mol/l的KH2PO4-NaOH緩沖液。繼續(xù)培養(yǎng)3h，測定飼料的蛋白質(zhì)消化率，確定出胰蛋白酶的最適用量為150IU（表2

1.2.2.3 離體消化程序
    ①胃蛋白酶處理
    a.稱取0.5g飼料樣品2份，分別置于250 ml帶蓋三角瓶中（每個樣品測2個平行樣）。
    b.準(zhǔn)確稱取1.777g胃蛋白酶（準(zhǔn)確到0.001g），置于體積100ml、pH值1.4的HCl-KCl緩沖液中。
    c.用移液管移取30ml上述混合液置于三角瓶中。
    d.將三角瓶置于（40±0.1）℃臺式恒溫?fù)u床中，以其溫度達(dá)到40℃時開始計時，震蕩3h，頻率為80次/min。
    ②胰蛋白酶處理
    a.準(zhǔn)確稱取4mg胰蛋白酶（準(zhǔn)確到0.001g），置于體積1 000ml、pH值6.8的KH2PO4-NaOH緩沖液中，放入冰箱中備用（溫度為4～6℃）。
    b.從搖床中按順序取下三角瓶，用0.2mol/ml NaOH溶液滴定消化液，使其pH值6.8，各量取15ml KH2PO4-NaOH緩沖液置于三角瓶中，然后再分別用移液管吸取15ml KH2PO4-NaOH-胰蛋白酶混合液置于另一個三角瓶中。
    c.繼續(xù)在（40±0.1）℃下震蕩培養(yǎng)3h。
    d.用320目尼龍濾布和抽濾裝置過濾消化液，并用溫水反復(fù)沖洗培養(yǎng)用的三角瓶（3～4次），將洗液加入消化液中過濾，用洗瓶多次沖洗濾渣。
    e.將濾渣放入65℃恒溫烘箱中烘干1h。
    f.用凱氏定氮法測定濾渣的含氮量，計算消化率。
    ③空白試驗
按上述各步驟進(jìn)行，但不加入樣品，測定胃蛋白酶-胰蛋白酶復(fù)合處理空白試驗的含氮量。
     1.2.2.4 體外消化率計算方法
粗蛋白消化率（%）= 100×（飼料樣品粗蛋白含量-消化后濾渣粗蛋白含量）/飼料樣品粗蛋白含量
   1.2.3 消化酶提取法
      1.2.3.1 粗酶液的提取
按照常規(guī)方法解剖取出魚的腸道和肝胰臟，去除脂肪和腸道內(nèi)容物后，用0.2M、pH值7.4的磷酸緩沖液按W/V為1：20稀釋，并用玻璃勻漿器勻漿后，在3 500r/min下離心20min，取上清液作為粗酶提取液，冷凍保存于冰箱中備用。
      1.2.3.2 離體消化率的測定
準(zhǔn)確稱量過80目的樣品各0.400g，放入100ml帶塞三角瓶中，加0.02M、pH值7.4的磷酸緩沖液40ml，粗酶液10ml，加入雙抗（青霉素150IU/ml、硫酸鏈霉素150IU/ml）。每隔4h加雙抗一次，置于（28±1）℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中，在以50次/min震蕩的搖床上進(jìn)行離體消化12h。每個樣品分別作2個平行樣。
      1.2.3.3 離體消化率的計算
魚類消化道的粗酶液離體消化12h后終止反應(yīng)，用定量濾紙過濾，并用溫水沖洗3～4次，取濾渣（含濾紙）在105℃下烘干至恒重并準(zhǔn)確稱重。凱氏定氮法測定飼料原料及其消化后相應(yīng)濾渣的粗蛋白含量。
粗蛋白消化率（%）= 100×（飼料樣品粗蛋白含量-消化后濾渣粗蛋白含量）/飼料樣品粗蛋白含量
2 結(jié)果
      2.1 飼料的粗蛋白含量
試驗所用的飼料原料采用凱氏定氮法測得其粗蛋白含量（見表3）。

2.2 飼料粗蛋白的體外消化率
消化液測定法（即胃蛋白酶-胰酶兩步消化法）、消化液提取法（提取鱸魚和草魚兩種消化液）測得的蛋白質(zhì)飼料消化率見表4。

3 分析與討論
      3.1 蛋白質(zhì)飼料原料
由表4可知，兩步法中酪蛋白的消化率最高，為96.9%；其次為棉籽粕和豆粕，其消化率分別為90.2%、89.9%；玉米蛋白粉、魚粉的消化率分別為83.4%和80.7%；酵母粉、菜籽粕的蛋白質(zhì)消化率均低于80%。試驗測得的常用蛋白質(zhì)消化率，與其他學(xué)者報道的有關(guān)體外消化率結(jié)果十分接近。酪蛋白、豆粕的消化率略低于pH值恒定法和體外消化法的測定值[4，5]。從鱸魚消化酶對蛋白質(zhì)飼料的消化率來看，酪蛋白最高為86.2%，其次為魚粉83.8%；在植物蛋白飼料中豆粕較高，接近于魚粉的消化率，為81.8%，而菜籽粕和棉籽粕的消化率較低，均小于50%；酵母粉和玉米蛋白粉的消化率最低，分別只有38.4%、36.3%。草魚消化酶對蛋白質(zhì)飼料的消化率數(shù)據(jù)顯示，酪蛋白仍然是最高的，為90.4%；其次為豆粕、菜籽粕和魚粉，分別為87.5%、 86.2%、 84.0%；玉米蛋白粉和棉籽粕的消化率為77.1%和75.2%；酵母粉的消化率最低，只有68.5%。值得注意的是，豆粕、菜籽粕的消化率均高于魚粉，這主要是由其草食性魚類的特點決定的，本試驗與羅莉等（1997）測定的結(jié)果相一致[6]。飼料及其蛋白質(zhì)在魚體消化道中被消化的程度取決于消化酶（消化蛋白質(zhì)的主要是蛋白酶）的作用時間，消化速度受消化酶的濃度、溫度、底物和作用時間的影響[11]。由鱸魚消化酶的試驗結(jié)果可知，其對魚粉具有很好的消化效果，而在3種植物蛋白飼料中，對豆粕的消化效果最好，其次為菜籽粕，對棉籽粕的消化效果最差。這與原料的種類和性質(zhì)有關(guān)。
      3.2 體外消化率測定方法
不同的消化方法測定的粗蛋白消化率存在顯著差異（P<0.05）。用兩步法測得的消化率普遍高于消化液提取法，前者的消化率在75.4%～96.9%之間變化，而后者用兩種消化液測得的消化率分別為36.3%～86.2%（鱸魚消化液）和68.5%～90.4%（草魚消化液）。在同一消化方法中，飼料的消化率之間也存在著顯著差異（P<0.05）。酪蛋白、魚粉、豆粕粗蛋白的消化率較高，均大于80%。兩步法中粗蛋白消化率的變化輻度為21.5%，鱸魚和草魚消化率的變化輻度為49.9%和21.9%。對鱸魚而言，植物蛋白飼料的消化率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于動物蛋白飼料，這主要是由其肉食性的特點決定的。相反地，兩步法和草魚消化液的數(shù)據(jù)則比較接近。兩步法消化體系得到的消化率值高于使用消化液的消化體系。目前體外消化率測定尚無統(tǒng)一方法，各種消化法中選用的酶的種類及酶活力都存在不同，消化條件（溫度、pH值、消化時間）、消化產(chǎn)物的分解以及測定方法也不同，這些因素可能影響消化率的測定結(jié)果。本試驗中的一些蛋白質(zhì)消化率高于動物體內(nèi)測得的結(jié)果，相應(yīng)飼料的消化率高于印遇龍測得的豬回腸末端蛋白質(zhì)表觀消化率。體外消化率是以消化后所有可溶性氮作為可消化的蛋白質(zhì)來計算的[7]，而表觀消化率是以回腸末端食糜中所有氮作為不可消化蛋白質(zhì)計算得出的，但并非回腸末端的食糜氮都是不可消化的飼料蛋白質(zhì)[8]，兩種消化方法涉及到內(nèi)源氮的差別，這可能導(dǎo)致本試驗測定值略高于印遇龍[7]的結(jié)果。Boisen研究認(rèn)為，對體外消化率進(jìn)行內(nèi)源氮校正后，可以準(zhǔn)確地預(yù)測回腸末端蛋白質(zhì)表觀消化率[2]，若對不同類別的飼料再考慮到灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維等成分，預(yù)測結(jié)果將會更準(zhǔn)確[9]。目前，許多研究表明，兩步消化法測得的蛋白質(zhì)消化率與動物體內(nèi)消化法測得的蛋白質(zhì)真消化率高度相關(guān)[8-10]。胃蛋白酶-胰酶兩步體外消化法可用于蛋白質(zhì)的測定，測定值不受內(nèi)源氮的影響。從草魚消化酶的試驗數(shù)據(jù)可知，作為草食性魚類，其對豆粕、菜籽粕的消化率要高于對魚粉的消化率，這主要是由魚體消化道和消化酶的特性所決定的。因此，在配制草食性魚類的人工養(yǎng)殖飼料中，可以適當(dāng)?shù)販p少魚粉的用量，增加豆粕等植物蛋白質(zhì)飼料的用量，不僅節(jié)省成本，也符合草食性魚類的消化規(guī)律。肉食性鱸魚對豆粕有很好的消化作用，從鱸魚消化酶對蛋白質(zhì)飼料的體外消化率來看，豆粕的結(jié)果與魚粉的結(jié)果較接近。因此，在配制肉食性魚類的人工養(yǎng)殖飼料中，可以適當(dāng)?shù)卦黾佣蛊傻挠昧浚M量減少魚粉等動物蛋白質(zhì)原料的用量，既有利于降低飼料成本，又能有效改善魚體的品質(zhì)、降低飼料物質(zhì)對水域環(huán)境的污染（魚粉的總磷很高、但利用率很低）。

4 結(jié)論
胃蛋白酶-胰酶兩步體外消化法在測定魚粉蛋白質(zhì)消化率時可以替代魚類消化液粗酶消化法，對于其它蛋白質(zhì)原料使用該方法應(yīng)慎重。

參考文獻(xiàn)
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孟俊英

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