求歧化酶的原理及操作方法

白荷

歧化酶的原理及操作方法是什么,還請各位老師多多幫忙

caihui205

這個很少用到,不知何解,等高手吧`

liwei986yc

（一）氮藍四唑法
1. 方法提要
在電子供體如甲硫氨酸存在下，核黃素受光激發(fā)，與電子供體反應被還原。在氧氣中，還原的核黃素與氧化反應產生

，

將無色（或微黃）的氮藍四唑還原為藍色的不溶性僭 ，SOD通過催化

歧化反應，生成O2與H2O2，從而抑制藍色形成。按抑制藍色特形成的50%為一酶活單位。酶活力越高，抑制50%藍色形成所需酶量越少。
2. 儀器
熒光燈管。
離心機。
分光光度計。
PH計。
3. 試劑
（1）磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O），磷酸二氫鉀（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮藍四唑（NBT），核黃素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上試劑均為分析純級；所用水為離子水或同等純度蒸餾水。
（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4緩沖液（于冰箱中保存）。
4. 測定步驟
（1）酶液的制備：稱取5~10g樣品，加預先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4緩沖液，緩沖液的量為所用樣品的10倍以上，在4℃條件下或冰浴中研磨成勻漿，四層紗布過濾，濾液經4000r/min離心20min，取上清液用于酶活測定。
（2）酶反應酬體系液的制備：取上述K2HPO4- KH2PO4緩沖液30ml，依次溶入Met，NBT，核黃素與EDTA，使它們的濃度分別為1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L與1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。
（3）測酶活在暗光下，取上述酶反應體系液3mL，移入試管中，試管放在一反應小室中，反應小室壁上貼錫箔紙，應將每個試管擺放在照光后所接受光強一致的位置。向每支試管加入25~30μL酶液。在25~30℃下用光強4000lx的熒光燈管（可用15W熒光燈）進行光照，15~20min后，出現顏色變化。停止光照。在560nm波長下比色測量透光度。用未加酶液的反應體系做對照。
5. 結果計算
以抑制藍色形成的50%為一個酶活單位。按下式計算：



式中 s——樣品照光后的透光度；
a——未加酶之反應液照光后透光度；
b——未加酶之反應液照光前透光度；
n——酶液稀釋倍數。
樣品酶活單位表示：SOD酶活單位（U）/g干重（g鮮重或g蛋白）。
6. 注釋
（1）進行照光操作時，應注意所用試管的直徑與管壁厚度基本一致。
（2）進行比色測定時，應用未加核黃素的酶反應體系液作空白。
（二）連苯三酚自氧化法
1. 方法提要
連苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出 ，生成帶色的中間產物。在自氧化過程的初始階段，黃色中間物的積累在滯后30~45s后就與時間成線性關系。中間產物在420nm處有強烈的光吸收，在有SOD存在時由于它能催化 生成O2與H2O2，從而阻止了中間物的積累，通過計算就可以求出SOD的活力。
2. 儀器
紫外分光光度計。
pH計。
3. 試劑
（1）連苯三酚，K2HPO4·3H2O，KH2PO4，HCl均為分析純級；所用水為去離子水或同等純度蒸餾水。
（2）連苯三酚液：用1×10-2mol/L HCl將之配成濃度5×10-2mol/L連苯三酚液。
（3）pH8.3, 5×10-2mol/LK2HPO4- KH2PO4緩沖液。
4. 測定步驟
（1）酶液的制備：除使用以上K2HPO4- KH2PO4緩沖液外，其他同氮藍四唑法。
（2）連苯三酚自氧化速率的測定：取4.5Ml ph8.3, 5×10-2mol/LK2HPO4- KH2PO4緩沖液，在25℃水浴中保溫15min，加入10μL5×10-2mol/L連苯三酚液，迅速搖勻（空白以K2HPO4- KH2PO4緩沖液代替），倒入光徑1cm的比色杯內，在420nm波長下于恒溫池中每隔30s測A值一次。計算線形范圍內每1min A的增值，此即為連苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。
（3）酶活測定：測定方法與測連苯三酚自氧化速率相同，在加入連苯三酚之前，先加入待測SOD酶液，緩沖液減少相應體積。計算加酶后測連苯三酚自氧化速率，按以下公式計算酶活。
5. 結果計算
樣品酶活單位表示同氮藍四唑法。



式中 A420nm/min——酶樣品在420nm處每分鐘光密度變化值；
V——反應液體積：
n——酶液稀釋倍數。

本篇文章來源于 超氧化物歧化酶（SOD）的測定方法|科學儀器在線 原文鏈接：http://www.hg17.com/knowledgeview1333.html

白荷

:酶提取義 生化培養(yǎng)箱 真空抽慮機 電動攪拌機 水浴鍋這幾種儀器又該如何操作歧化酶及原理