肽的測定方法

獅山跳蚤

看到很多討論小肽的測定方法的，這里有個比較準確的方法，希望對各位有幫助！

小小學(xué)徒

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獅山跳蚤

飼料中水溶性活性肽含量測定
一、        范圍
    本標準規(guī)定了飼料中水溶性活性肽含量測定方法。
    本標準適用于飼料原料、配合飼料。檢測范圍為比色溶液中活性肽含量15mg/ml。
二、        引用標準
       下列標準所包含的條文，通過本標準中引用而構(gòu)成為本標準的條文，本標準出版時，所示版本均為有效，所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應(yīng)探討使用下列標準最新版本的可能性。
       GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法
三、        方法原理
先將試樣中可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸和氨在水中提取出來，部分提取液在110℃，6mol/l鹽酸中水解成單個氨基酸，經(jīng)茚三酮顯色反應(yīng)在570nm處測定總氨基酸氮含量，空白以提取液未水解直接與茚三酮顯色反應(yīng)在570nm處測定的游離氨基酸氮含量，水溶性活性肽含量即是總氨基酸氮含量減去游離氨基酸氮含量。
四、        試劑
本標準所用試劑，出特殊說明外，均為分析純。
實驗室用水應(yīng)符合GB/T6682中三級水的規(guī)格。
4.1  乙酸鈉緩沖液4M  PH5.5：稱32.8g無水乙酸鈉于100ml容量瓶加60ml去離子水，緩慢加熱溶解，冷后加10ml冰乙酸，用水定容,貯存?zhèn)溆谩?br /> 4.2  鹽酸（GB622）
4.3  0.1mol/l鹽酸：8.3ml鹽酸（GB622）注入1000ml水中，貯存?zhèn)溆谩?br /> 4.4  茚三酮：稱1.67g茚三酮(HG3-984-76)于250ml容量瓶，加125ml乙二醇甲基醚（Fisher E182）,加7ml冰乙酸，25ml 4M NaAc緩沖液（4.1），用水定容，該試劑可穩(wěn)定一年，貯存棕色瓶中。
4.5         硫酸肼：稱0.26g硫酸肼（GB698-77）到1升容量瓶，溶于去離子水，加 3-4 滴濃H2SO4,用去離
子水定容，貯存棕瓶可穩(wěn)定1年。
4.6         三氯乙酸：25g三氯乙酸(HG3-1105-77)于100ml容量瓶中，加水定容。
4.7         氨基酸標準貯備液：（1000mg氨基酸氮/L）
將L-亮氨酸（L-leucine）含氮10.67%在真空干燥皿中50℃ 干燥過夜。稱0.937g干燥L(fēng)-亮氨酸于100ml容量瓶，并用0.1mol/l鹽酸（4.3）溶解，并用0.1mol/l鹽酸（4.3）定容，此溶液4℃ 下可穩(wěn)定一個月。
4.8         氨基酸標準工作液：
移2、4、6、8、10ml標準貯備液（4.7）于100ml溶量瓶中，用0.1mol/l鹽酸（4.3）定容成20、40、60、80和100mg氨基氮/L,此溶液4℃下可穩(wěn)定一個月。
五、儀器、設(shè)備
5.1        實驗室用樣品粉碎機
5.2        分析天平
5.3        磁力攪拌器
5.4        渦流混合儀
5.5        離心機
5.6        反應(yīng)瓶：類似安瓿瓶，能密封
5.7        電熱恒溫箱：110℃±1℃
5.8        注射過濾器：帶0.45μm濾紙
5.9        真空干燥器
5.10        電熱恒溫水?。?0℃1±1℃
5.11        分光光度計：備1cm比色杯，570nm
六、        試樣的制備
選取有代表性的飼料樣品，至少500克，用四分法縮減至100克，磨碎，并過0.25mm孔徑（60目），充分混均后裝入磨口瓶中備用。
七、分析步驟
7.1  提取
稱取約2g樣品，精確至0.001g于磁力攪拌器（5.3）中加入20ml水，強力快速攪拌2min，用快速濾紙過濾，收集濾過物（置于4℃冰箱中）。
7.2  提純
取上述提取液（7.1）8ml于離心管中，加2ml  25%三氯乙酸（4.6），并用渦流混合儀（5.4）混均，室溫下放置反應(yīng)1h后，用離心機（5.5）離心2500r×25min，移取上清液于另一試管中備用（或置于4℃冰箱中）。
7.3 水解
取2ml提純待測液（7.2）于5ml反應(yīng)瓶中（5.6），加2ml鹽酸（4.2）混均、抽真空、沖氮氣并密封，于電熱恒溫箱（5.7）110℃水解24h后，取出冷卻至室溫；用注射過濾器（5.8）過濾，取濾液1ml于另一個5ml小燒杯中并置于真空干燥器（5.9），抽真空，直到樣品完全干燥，再加4ml水溶解燒杯中殘渣，待測。
7.4  標準曲線測定
取各個氨基酸標準工作液（4.8）0.2ml， 0.1mol/l鹽酸（4.3）0.2ml于20ml比色管中，各加2ml茚三酮溶液（4.5）和10ml硫酸肼溶液（4.4），混均，置于90℃水浴（5.10）15min，取出快速冷卻至室溫，以鹽酸空白比色為參照用1cm比色杯于分光光度計（5.11）570nm處測試吸光度，以氨基酸氮含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。
7.5  試樣的測定
    準確移取提純液（7.2）0.2ml于20ml比色管中，按7.4的方法步驟測定吸光度，從標準曲線（7.4）查得試樣提純液的氨基酸氮含量(a)。
7.6  水解樣的測定
     準確移取水解后水溶解樣品液（7.3）0.2ml于20ml比色管中，按7.4的方法步驟測定吸光度，從標準曲線（7.4）查得試樣水解液的氨基酸氮含量(b)。
八、        定結(jié)果的計算
樣品中活性肽總氮含量（mg/kg）按下式計算：
水溶性活性肽含量（mg/kg）=（b/m ×mb¬¬¬—a/m×ma ）×3.07

式中：
a   ——由標準曲線查得試樣液氨基酸氮含量
b   ——由標準曲線查得水解液氨基酸氮含量
ma  ——試樣稀釋倍數(shù)
mb  ——水解樣稀釋倍數(shù)
m  ——樣品的質(zhì)量
3.07——氮和肽之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)
九、        允許誤差
同一分析者對同一試樣兩次測定所得結(jié)果相對偏差≤10%。

獅山跳蚤 于 2010-7-16 10:23 補充以下內(nèi)容

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小小學(xué)徒 發(fā)表于 2010-7-16 10:18

    貼出來了不知道王博士有沒意見，以后沒人充值了，呵呵

寧靜的港灣

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柳粒橙

有好的知識和技術(shù)大家一起共享呀，謝謝！