HPLC法測定飼料中喹乙醇殘留及應(yīng)用

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　　HPLC法測定飼料中喹乙醇殘留及應(yīng)用

　?、賱⒕S華 ①陳 娟 ②張巨順 ③吳 靜

　　寧夏動物食品質(zhì)量安全檢測中心(銀川 · 750001)

　　摘要 建立HPLC法測定飼料中喹乙醇的殘留，具有很好的分離度，濃度10ug/mL～100ug/mL范圍呈良好的線性關(guān)系，R=0.99998。回收率范圍為85.8%～99.4%，批內(nèi)變異系數(shù)≤5.7%,批間變異系數(shù)≤1.1%。檢測24批雞配合料，喹乙醇殘留未檢出，檢測62批魚飼料，喹乙醇殘留檢出率為8.1 %，檢出的樣品中，殘留量范圍為19.7～42.0mg/kg 。表明魚飼料中存在喹乙醇殘留隱患。
　　關(guān)鍵詞 HPLC法 測定 喹乙醇 殘留 應(yīng)用
　　1 前言
　　喹乙醇為喹堊啉類二氧化物。外觀為淺黃色結(jié)晶性粉末，無臭，味苦，屬抗菌藥，在飼料中添加可促進畜禽生長。通常與淀粉或麩皮、磷酸氫鈣、碳酸鈣配制成飼料預(yù)混劑來使用。本品對豬的毒性較小，但仔豬超量易中毒，可引起腎小球損害;家禽對本品敏感、安全范圍小。殘留于動物組織中的喹乙醇以3-甲基喹惡啉-2-羧酸成分存在，它是一種基因毒劑，生殖腺誘變劑，通過食物進入人體，形成殘留蓄積，會明顯的影響機體的代謝平衡，可引起光敏反應(yīng)、有致突變、致畸、致癌性，對人體尤其胎兒和兒童發(fā)育造成很大的危害。因此，中國獸藥典規(guī)定，禁用于禽、魚，體重超過35kg的豬禁用。筆者建立HPLC法測定禽、魚飼料中喹乙醇的殘留，進行了方法學(xué)考察并加以應(yīng)用，現(xiàn)將試驗結(jié)果匯報如下：
　　2 試驗方法
　　2.1 主要儀器
　　Agilent 1100 高效液相色譜儀，配FLD檢測器和ALS自動進樣器;AM-6型ACE破碎乳化儀(日本精機制作所);高速冷凍離心機(HITACHI)，WSZ-100-A振蕩器(上海安亭科學(xué)儀器廠);移液器(Fin npipette);微孔濾膜(孔徑0.45um);
　　2.2主要試劑
　　喹乙醇：含量99.6%，批號H0060305，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;甲醇：色譜純，
　　乙酸：分析純，水為去離子水。
　　試料來源：共86份，寧夏飼料生產(chǎn)企業(yè)雞配合料24份，漁塘自配料62份。
　　2.3 色譜條件
　　色譜柱(ZOR BAX Eclipse XDB-C18,4.6×250mm);流動相：15%甲醇，流速：
　　0.9ml/min;柱溫：室溫;進樣量：5μL;檢測波長：260 nm。
　　※ ①寧夏動物食品質(zhì)量安全檢測中心②寧夏中衛(wèi)市飼料工業(yè)辦公室 ③寧夏農(nóng)業(yè)學(xué)校04級畢業(yè)生
　　2.4標準溶液的制備
　　精密稱取喹乙醇標準品各0.05020g置 50 mL棕色瓶中，用5%甲醇60℃超聲水浴溶解并定容。搖勻即得1.0mg/ml喹乙醇標準儲備液;
　　精密量取儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，置 100 ml容量瓶中，用5%的甲醇稀釋至刻度，得10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 ug/ml喹乙醇標準系列工作溶液。
　　2.5試料提取
　　稱取飼料試料5.0g，置具塞錐形瓶中，加0.5g碳酸鉀和5%的甲醇50ml，具塞置如入搖床200r/min振蕩30min，將上清液轉(zhuǎn)入離心管，以10000r/min離心15分鐘，取上清液用0.45um濾膜過濾，上機測定。
　　2.6陽性添加試料的制備
　　精密量取喹乙醇標準儲備液1.0ml，置于5g空白試樣的具塞錐形瓶中，同試料提取方法，得到200mg/kg的陽性添加試料;精密量取喹乙醇標準儲備液4.0ml，置于5g空白試樣中，制備成800mg/kg的陽性添加試料。
　　2.7計算
　　陽性添加試料回收率計算公式：R=X/X0×100%
　　式中： X：實測添加量(mg/kg);X0：添加量(mg/kg)。
　　殘留量X=C·V/m
　　式中X：飼料中喹乙醇的含量;(mg/kg) C：由標準曲線計算所得的樣液濃度;(μg/ml)
　　V：稀釋體積;V=50(ml)
　　m：供試試料的質(zhì)量(g)
　　3 試驗結(jié)果
　　3.1標準曲線
　　在上述色譜條件下測定標準系列溶液，喹乙醇的保留時間8.5～8.8分鐘，回歸方程為：
　　Y=34.96632X-5.20610 R=0.99998
　　在上述色譜條件下，喹乙醇的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性范圍為10mg/mL～100mg/mL。
　　3.2加標回收率
　　在空白試料中做200mg/kg、800mg/kg兩個水平陽性添加，每水平做4份平行樣品，每份結(jié)果取2針平均值，考察3次。喹乙醇的回收率、批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)見表1、2。
　　表-1 喹乙醇200mg/kg添加樣品結(jié)果匯總表

類別		第一批			第二批			第三批
樣品編號		稱樣量（g）	實測濃度（μg/kg）	回收率（%）	稱樣量（g）	實測濃度（μg/kg）	回收率（%）	稱樣量（g）	實測濃度 （μg/kg）	回收率（%）
空白		5.00	0		5.00	0		5.00	0
1		5.00	18.5	92.3	5.00	18.5	92.5	5.00	18.9	94.3
2		5.00	18.2	90.9	5.00	18.8	94.0	5.00	18.8	93.8
3		5.00	19.4	96.8	5.00	18.5	92.5	5.00	18.7	93.3
4		5.00	18.5	92.5	5.00	19.3	96.5	5.00	19.9	99.4
平均值			18.6	93.1		18.8	93.9		19.1	95.2
變 異	批內(nèi)（%）	2.8			2.0			2.8
	批間（%）	1.1
回收率范圍		90.9～99.4%

　　表-2 喹乙醇800mg/kg添加樣品結(jié)果匯總表

類別		第一批			第二批			第三批
樣品編號		稱樣量（g）	實測濃度（μg/kg）	回收率（%）	稱樣量（g）	實測濃度（μg/kg）	回收率（%）	稱樣量（g）	實測濃度 （μg/kg）	回收率（%）
空白		5.00	0		5.00	0		5.00	0
1		5.00	73.2	91.2	5.00	68.6	85.8	5.00	72.3	90.4
2		5.00	72.8	91.0	5.00	68.8	86.0	5.00	70.6	88.3
3		5.00	72.7	91.0	5.00	75.8	94.8	5.00	71.5	89.4
4		5.00	72.9	91.1	5.00	75.9	94.9	5.00	71.9	89.9
平均值			72.9	91.1		72.3	90.4		71.6	89.5
變 異	批內(nèi)（%）	0.30			5.7			1.0
	批間（%）	0.90
回收率范圍		85.8～94.9%

　　3.3重復(fù)性
　　對不同濃度的溶液室溫放置72小時，每天測定其濃度，考察重復(fù)性或穩(wěn)定性。結(jié)果見表-3。
　　表-3　 不同濃度喹乙醇溶液72小時峰面積變化情況

濃度（ug/ml）	10.0	20.0	40.0	60.0	80.0	100.0
第一天峰面積	347.30	689.38	1390.97	2092.46	2775.65	3508.29
第二天峰面積	350.55	688.53	1389.16	2093.02	2777.40	3497.36
第三天峰面積	330.22	651.26	1380.07	2092.65	2775.46	3487.55
平均峰面積	342.69	676.39	1386.73	2092.71	2776.17	3497.73
變異系數(shù)（%）	3.2	3.2	0.42	0.01	0.04	0.30

　　4應(yīng)用
　　用本方法對寧夏飼料生產(chǎn)企業(yè)雞配合料24份，漁塘自配料62份進行喹乙醇殘留檢測，統(tǒng)計結(jié)果見表4。
　　表-4 飼料中喹乙醇殘留監(jiān)測結(jié)果匯總表

樣品來源	抽樣數(shù)（批）	檢出數(shù)（批）	檢出率 （%）	超標數(shù)（批）	超標率（%）
雞配合飼料	24	0	0	0	0
淡水魚自配料	62	5	8.1	5	8.1
合 計	86	5	5.8	5	5.8
飼料中喹乙醇殘留檢出的范圍 19.7～ 42.0mg/kg

　　5總結(jié)與討論
　　5.1方法學(xué)考察
　　5.1.1標準曲線表明：HPLC法檢測喹乙醇的含量在10.0ug/ml～100.0ug/ml范圍呈良好線性關(guān)系，喹乙醇出峰保留時間為8.5～8.8分鐘之間，前后幾乎無干擾峰，分離度很好，回歸方程相關(guān)系數(shù)R=0.99998。
　　5.1.2加標回收率試驗結(jié)果表明：200μg/kg陽性添加，喹乙醇平均回收率94.1%,回收率范圍90.9%～99.4%，三次考察批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.8%、2.0%、2.8%，批間變異系數(shù)為1.1%。800μg/kg陽性添加喹乙醇平均回收率90.3%，回收率范圍85.8%～94.9%，三次考察批內(nèi)變系數(shù)為0.3%、5.7%、1.0%，批間變異系數(shù)0.9%。綜上所述，該方法檢測喹乙醇殘留，陽性添加回收率范圍85.8%～99.4%，批內(nèi)變異系數(shù)≤5.7%,批間≤1.1%。200μg/kg陽性添加的平均回收率高于800μg/kg陽性添加的平均回收率3.8%。
　　5.1.3用5%甲醇配制的喹乙醇標準品溶液，室溫放置三日測定結(jié)果較為穩(wěn)定。由表3可得，隨著對照溶液濃度的稀釋梯度降低，重復(fù)測定峰面積的穩(wěn)定性變差。喹乙醇標準品溶液濃度為60.0μg/ml時，三日重復(fù)性最穩(wěn)定，變異系數(shù)為0.01%;喹乙醇標準品溶液濃度10.0μg/ml、20.0μg/ml時，三日重復(fù)性最不穩(wěn)定，變異系數(shù)為3.2%。
　　5.2 方法應(yīng)用及殘留隱患分析
　　經(jīng)過方法學(xué)考察的HPLC法，測定雞配合飼料、魚飼料中的喹乙醇殘留，表4表明。雞配合飼料中的喹乙醇殘留未檢出，魚飼料中的喹乙醇殘留檢出率為8.1%，檢出的樣品中殘留量范圍為19.7mg/kg～42.0mg/kg。說明，為了促進生長，魚飼料中非法添加喹乙醇的現(xiàn)象存在，這與筆者2006年魚肉中喹乙醇殘留檢測的結(jié)果是一致的。這就要求漁政管理部門和飼料管理部門應(yīng)該起抓共管，嚴厲打擊違禁藥物的非法使用，確保水產(chǎn)品質(zhì)量的安全。
　　5.3結(jié)論
　　本方法測定飼料中喹乙醇的殘留，檢測條件穩(wěn)定，加標回收率高，變異系數(shù)較小，可操作性強，應(yīng)用簡單方便。對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心開展養(yǎng)殖業(yè)投入品中違禁藥物的殘留檢測工作具有現(xiàn)實指導(dǎo)意義。
　　參考文獻
　　[1] 中國獸藥典委員會，《獸藥使用指南》二○○五年版，中國農(nóng)業(yè)出版社，P90。
　　[2] 農(nóng)牧發(fā)[2007]7號。.
　　[3]劉維華等，《畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗技術(shù)》， 第二章，第十一節(jié)，P54。
　　[4] GB/T8381.7-2005《飼料中喹乙醇的測定 高效液相色譜法》。
　　作者簡介：劉維華，男，1967年2月出生，1990年西北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)系畢業(yè)，寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所工作，高級獸醫(yī)師。從事獸藥、飼料、藥物殘留、食品質(zhì)量安全檢驗17年，發(fā)表論文30余篇，主編《畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗技術(shù)》20萬字，三項科研成果獲自治區(qū)科技進步二、三等獎。

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好資料，lz好人