葉黃素的測(cè)定方法研究

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[p=30, 2, center]　[size=2]　[b]葉黃素的測(cè)定方法研究[/b][/size][/p][p=30, 2, center][b]　　趙小陽(yáng) 田河山[/b][/p]
　　葉黃素(Lutein)又名“植物黃體素”，分子式C40H56O2，分子量為568.88,屬類胡蘿卜素活性物質(zhì),因?yàn)楣に囂珡?fù)雜,人工合成單一異構(gòu)體的葉黃素至今尚未成功,目前只有萬(wàn)壽菊花朵等天然植物中提取的葉黃素才含具有抗氧化作用的活性物質(zhì),作為飼料添加劑著色劑主要添加到肉雞、蛋雞、鴨、魚飼料中，可使動(dòng)物皮膚脂肪變黃，蛋心變紅，使商品肉類蛋類品質(zhì)提升，營(yíng)養(yǎng)增加。工業(yè)色素是許多國(guó)家禁止使用的色素，在飼料中添加工業(yè)色素(黃色化學(xué)合成染料)，會(huì)對(duì)人體造成危害，食品安全的需要對(duì)飼料添加劑的安全性提出了更高的標(biāo)準(zhǔn)，本文主要介紹利用高效液相色譜法和分光光度法測(cè)定葉黃素的含量，其中高效液相色譜法可鑒別其他色素如蘇丹紅、日落黃、檸檬黃等的干擾，適合以植物萬(wàn)壽菊中脂溶性提取物為原料，經(jīng)皂化后，制成水劑或采用淀粉、玉米芯粉、白炭黑等輔料，有效成分主要是葉黃素和它的同分異構(gòu)體玉米黃質(zhì)，也有少量的其它類胡蘿卜素和臘質(zhì)，在飼料工業(yè)中作為著色劑類飼料添加劑葉黃素的檢測(cè)。
　　1. 實(shí)驗(yàn)方法
　　除特殊說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，標(biāo)準(zhǔn)溶液和雜質(zhì)溶液的制備應(yīng)符合GB/T602和GB/T603的規(guī)定。
　　1.1 試劑和溶液
　　1.1.1 正己烷：色譜純。
　　1.1.2 乙酸乙酯：色譜純。
　　1.1.3 正己烷。
　　1.1.4 無(wú)水乙醇。
　　1.1.5 丙酮。
　　1.1.6 甲苯。
　　1.1.7 提取劑:正己烷+乙醇+丙酮+甲苯=10+6+7+7(V+V+V+V)。
　　1.2 儀器和設(shè)備
　　實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備;
　　1.2.1 超聲波水浴。
　　1.2.2 紫外分光光度計(jì)。
　　1.2.3 石英比色皿(1cm)。
　　1.2.4 高效液相色譜儀，帶紫外可調(diào)波長(zhǎng)檢測(cè)器(或二極管矩陣檢測(cè)器)。
　　1.3 鑒別試驗(yàn)
　　1.3.1 原理
　　葉黃素含量以總類胡蘿卜素含量表示，試樣中總類胡蘿卜素經(jīng)混合溶劑提取后，注入正相色譜柱上，用流動(dòng)相洗脫，分離出葉黃素和玉米黃質(zhì)，其色譜峰的分離度為3.06-3.09,葉黃素含量應(yīng)在70%以上，玉米黃質(zhì)含量在10%以上，并通過(guò)峰面積比例測(cè)知其相對(duì)含量。
　　1.3.2 試樣溶液的制備
　　根據(jù)產(chǎn)品含量，稱取試樣約0.15g～0.2g，(精確至0.0002g)，置于100mL棕色容量瓶中，加提取劑(1.1.7)約80mL，在超聲波水浴中加熱超聲提取20min，冷卻至室溫，用提取劑(1.1.7) 定容至刻度，混勻，過(guò)濾,用移液管準(zhǔn)確移取1mL濾液到10mL容量瓶中,用氮?dú)獯蹈?用流動(dòng)相稀釋至刻度,混勻,溶液過(guò)0.45μm濾膜，供高效液相色譜儀分析。
　　1.3.3 色譜條件：
　　固定相：硅膠柱：內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)250mm，粒度3µm。
　　流動(dòng)相：正己烷+乙酸乙脂=70+30(V+V)，超聲脫氣。
　　流速： 1.5mL/min。
　　檢測(cè)器：紫外可調(diào)波長(zhǎng)檢測(cè)器(或二極管矩陣檢測(cè)器)，檢測(cè)波長(zhǎng)446nm或474nm。
　　進(jìn)樣量：20µL。
　　1.3.4 試樣測(cè)定：將試樣分析液(1.3.2),按上述色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析,得到葉黃素和玉米黃質(zhì)，色譜峰可參見(jiàn)圖1。
　　1.3.5 結(jié)果計(jì)算：
　　葉黃素(%)=總類胡蘿卜素量×葉黃素的峰面積% …………………(1)
　　玉米黃質(zhì)(%)=總類胡蘿卜素量×玉米黃質(zhì)的峰面積% ……………(2)
　　1.4 葉黃素含量的測(cè)定
　　1.4.1 原理
　　葉黃素在波長(zhǎng)446nm±1nm處有最大吸收，可根據(jù)該波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度和標(biāo)準(zhǔn)百分吸光系數(shù)( )計(jì)算其含量。
　　1.4.2 試樣溶液的制備
　　根據(jù)產(chǎn)品含量，稱取試樣約0.15g～0.2g，(精確至0.0002g)，置于100mL棕色容量瓶中，加約80mL無(wú)水乙醇(1.1.4)，在超聲波水浴中加熱超聲提取20min，冷卻至室溫，用無(wú)水乙醇(1.1.4)定容至刻度，混勻，過(guò)濾，用移液管準(zhǔn)確移取1mL濾液到10mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇(1.1.4)稀釋至刻度,混勻。
　　1.4.3 試樣的測(cè)定
　　將試樣分析液(1.4.2)置于1cm石英池中,用紫外分光光度計(jì),在波長(zhǎng)446nm±1nm處測(cè)定吸收度A,以無(wú)水乙醇(1.1.4)為空白對(duì)照。
　　1.4.4 計(jì)算和結(jié)果的表示
　　試樣中葉黃素(C40H56O2)(以總類胡蘿卜素計(jì))含量X以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)表示，按式(3)計(jì)算：
　　X= …………………(3)
　　式中：
　　A—試料(1.4.2)吸收度讀數(shù);
　　1000—試料(1.4.2)稀釋倍數(shù);
　　m—試料質(zhì)量，單位為克(g);
　　2550—葉黃素百分吸光系數(shù)( =2550);
　　平行測(cè)定結(jié)果用算術(shù)平均值表示,保留三位有效數(shù)字。
　　1.4.5 重復(fù)性
　　同一分析者對(duì)同一試樣同時(shí)兩次平行測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)值之差應(yīng)不大于0.3%。
　　2. 產(chǎn)品含量檢驗(yàn)方法的建立
　　2.1 色譜條件的選擇
　　樣品的乙醇溶液用分光光度計(jì)測(cè)定，以1cm石英比色皿在420～480nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定試樣溶液的吸收光譜，在445nm±1nm、473nm±1nm的波長(zhǎng)處有最大吸收峰，光譜圖見(jiàn)圖一，色譜圖見(jiàn)圖二。
　　圖一:
　　
　　No. nm Abs
　　1 473.50 0.589
　　2 445.00 0.687
　　圖二:
　　
　　葉黃素保留時(shí)間：14.801min,玉米黃質(zhì)保留時(shí)間：18.292min。
　　2.2 提取劑的選擇
　　葉黃素含量測(cè)定方法采用紫外分光光度法，我們選擇兩種提取劑做比較，參照J(rèn)ECFA(2004)方法中用正己烷+乙醇+丙酮+甲苯=10+6+7+7(V+V+V+V)做樣品提取劑，根據(jù)葉黃素易溶于乙醇的性質(zhì)，用乙醇做樣品提取劑，用分光光度計(jì)測(cè)定，以1cm石英比色皿在445nm波長(zhǎng)處測(cè)定試樣溶液的吸收光譜，我們收集不同廠家產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定，對(duì)比測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表一。
　　表一 不同提取劑測(cè)定結(jié)果對(duì)比[table]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋體]生產(chǎn)廠家[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]混合溶劑提?。?）[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]無(wú)水乙醇提?。?）[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋體]廠家一[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.47[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.55[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋體]廠家二[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.41[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.36[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,205][p=30, 2, center][font=宋體]廠家三[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.18[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][td=1,1,206][p=30, 2, center][font=宋體]1.29[/font][font=宋體][size=10.0pt][/size][/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　兩種提取劑測(cè)定結(jié)果差異不大，考慮到甲苯對(duì)人體危害較大,本方法樣品中葉黃素含量的測(cè)定采用無(wú)水乙醇做提取劑,方法簡(jiǎn)單,結(jié)果準(zhǔn)確。
　　2.3 不同廠家生產(chǎn)的飼料添加劑葉黃素檢驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)示量對(duì)比
　　選取不同廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品,按照本方法確定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行含量的測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表二。
　　表二 不同廠家的產(chǎn)品含量檢驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)示量對(duì)比[table]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]樣品代號(hào)[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]葉黃素含量檢驗(yàn)結(jié)果（%）[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]葉黃素標(biāo)示量（%）[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]占標(biāo)示量（%）[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]1[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]1.52[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]1.60[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]95[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]2[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]1.82[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]1.60[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]114[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]3[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]1.36[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]1.50[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]91[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]4[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]2.24[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]2.00[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]112[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]5[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]2.18[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]2.00[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]109[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,114][p=30, 2, center][font=宋體]6[/font][/p][/td][td=1,1,192][p=30, 2, center][font=宋體]1.38[/font][/p][/td][td=1,1,181][p=30, 2, center][font=宋體]1.50[/font][/p][/td][td=1,1,170][p=30, 2, center][font=宋體]92[/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　以上結(jié)果表明, 按照本方法測(cè)定樣品含量，均為樣品標(biāo)示量的90%以上,本方法有較好的準(zhǔn)確度。
　　2.4 方法精密度(重復(fù)性)
　　選取同一批葉黃素飼料添加劑，按照本方法確定的條件進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，制備五份溶液，測(cè)試飼料添加劑葉黃素的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表三。
　　表三 同一樣品重復(fù)測(cè)定五次結(jié)果[table]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]測(cè)定次數(shù)[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]葉黃素含量(%)[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]1[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2.35[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2.17[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]3[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2.24[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]4[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2.19[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]5[/font][/p][/td][td=1,1,328][p=30, 2, center][font=宋體]2.21[/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　對(duì)于同一樣品，其變異系數(shù)(CV%)為3.2%，本方法有較好的精密度、重復(fù)性。
　　2.5 同一分析者對(duì)同一試樣同時(shí)兩次平行測(cè)定結(jié)果絕對(duì)值之差的確定
　　選擇不同產(chǎn)品做兩次平行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表四。
　　表四 不同產(chǎn)品兩次平行測(cè)定結(jié)果絕對(duì)值之差[table]
[tr][td=1,1,160][p=30, 2, center][font=宋體]樣品代號(hào)[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]葉黃素含量[/font][/p][p=30, 2, center][font=宋體]
[/font][font=宋體]（%）[/font][/p][/td][td=1,1,156][p=30, 2, center][font=宋體]絕對(duì)值之差[/font][/p][p=30, 2, left][font=宋體]（%）[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋體]1[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.55[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋體]0.03[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.52[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋體]2[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.99[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋體]0.17[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.82[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋體]3[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.57[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋體]0.02[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]1.55[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋體]4[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]2.17[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋體]0.07[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]2.24[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,2,160][p=30, 2, center][font=宋體]5[/font][/p][/td][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]2.56[/font][/p][/td][td=1,2,156][p=30, 2, center][font=宋體]0.19[/font][/p][/td][/tr]
[tr][td=1,1,224][p=30, 2, center][font=宋體]2.37[/font][/p][/td][/tr]
[/table]
　　測(cè)定結(jié)果表明，本方法兩次平行測(cè)定結(jié)果絕對(duì)值之差均小于0.3%,在實(shí)驗(yàn)方法中,將該值定為小于0.3%。
　　實(shí)驗(yàn)證明,本方法有較好的準(zhǔn)確度與精密度,方法合理,操作便捷,適合飼料添加劑葉黃
　　素的檢測(cè)。
　　趙小陽(yáng) 國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(北京)，化學(xué)分析高級(jí)實(shí)驗(yàn)師。
　　田河山 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究員

微生態(tài)岳陽(yáng)

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