反相HPLC測(cè)定青霉素的方法改良

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　　反相HPLC測(cè)定青霉素的方法改良

　　劉維華 夏淑鴻 陳娟 趙娟 陳建蓉 高欣

　　[摘 要] 用0.9%氯化鈉溶液取代水溶液溶解青霉素，按照CVP2005的
　　方法測(cè)定青霉素含量，得到相同的測(cè)定結(jié)果。該方法重復(fù)性好，對(duì)時(shí)間穩(wěn)
　　定，優(yōu)于藥典的方法測(cè)定青霉素的含量，對(duì)批量樣品自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定誤差
　　小，檢驗(yàn)結(jié)果更可靠;對(duì)獸藥典檢驗(yàn)方法的制修訂具有參考價(jià)值。
　　[關(guān) 鍵 詞] HPLC 測(cè)定 青霉素
　　青霉素對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌及陰性球菌、少數(shù)革蘭氏陰性桿菌、螺旋體和放射菌有強(qiáng)大的抗菌作用，所以獸醫(yī)臨床上應(yīng)用非常廣泛。Fleming于1929年首先發(fā)現(xiàn)了青霉素，國(guó)內(nèi)于1953年開(kāi)始生產(chǎn)。本品經(jīng)產(chǎn)黃青霉菌的雜交菌珠發(fā)酵玉米漿、乳糖和無(wú)機(jī)鹽，反復(fù)轉(zhuǎn)提、純化而得。濃縮后的青霉素G游離酸的醋酸丁酯溶液中加入醋酸鉀乙醇溶液既得青霉素G鉀鹽;再經(jīng)醋酸丁酯轉(zhuǎn)提，加入醋酸鈉乙醇溶液即得青霉素G鈉鹽。青霉素分子由游離羧基、酰胺側(cè)鏈、氫化噻唑環(huán)和β-內(nèi)酰胺環(huán)合并的雜環(huán)構(gòu)成，本品結(jié)構(gòu)最不穩(wěn)定的部分是β-內(nèi)酰胺，在偏堿或偏酸條件下易發(fā)生水解和分子重排，在干燥條件下較穩(wěn)定。本品含量測(cè)定經(jīng)歷了微生物法、羥胺法、碘量法、咪唑法、酸堿中和法、電位滴定法等演變和取代，《中華人民共和國(guó)獸藥典》二○○五年版(CVP2005)規(guī)定的測(cè)定方法為液相色譜法。筆者在應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其水溶液重現(xiàn)性不穩(wěn)定，容易降解，對(duì)測(cè)定結(jié)果會(huì)造成較大偏差，結(jié)合獸醫(yī)臨床使用經(jīng)驗(yàn)，用0.9%氯化鈉溶液替代水溶解試樣，得到較理想的結(jié)果。匯報(bào)如下：
　　1. 試驗(yàn)方法
　　1.1 主要儀器
　　Agilent 1100 高效液相色譜儀，配VWD檢測(cè)器和ALS自動(dòng)進(jìn)樣器
　　1.2 主要試劑
　　青霉素對(duì)照品：含量92.7%，批號(hào)K0251206，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提
　　供;乙腈：色譜純;磷酸二氫鉀：分析純;水為去離子水。
　　試樣：市場(chǎng)抽檢的青霉素鉀樣品5批，青霉素鈉樣品1批。
　　1.3 色譜條件
　　色譜柱(ZORBAX SB-C18,4.6×150mm);流動(dòng)相：0.1mol/L磷酸二
　　氫鉀溶液(用磷酸調(diào)pH值至2.5)—乙腈(70：30);柱溫：20℃;流
　　速：1.0ml/min;進(jìn)樣量：10μL;檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm。
　　1.4 測(cè)定方法
　　取本品適量，精密稱(chēng)定，加溶劑溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.5mg的溶液，搖勻，精密量取10ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。青霉素鈉測(cè)定結(jié)果乘以1.0658;青霉素鉀測(cè)定結(jié)果乘以1.1136。
　　2. 試驗(yàn)結(jié)果
　　2.1 方法考察 分別以水、流動(dòng)相、乙醇、0.9%氯化鈉溶液4種溶劑為青霉素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，分別確定青霉素溶液現(xiàn)配、放置24h、放置48h、放置72h后液相色譜圖中峰面積的變化，考察其重復(fù)性和穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。
　　表1 改良方法與藥典方法測(cè)定青霉素穩(wěn)定性比較

使用方法	使用溶劑	測(cè)定時(shí)間	主成分含量（%）	降解物之和（%）	理論回收率（%）
藥典方法	水溶解	現(xiàn)配溶液	100.0（n=6）	0	100.0
		放置24h	88.2（n=6）	8.2	88.2
		放置48h	43.3（n=6）	35.4	43.3
		放置72h	23.9（n=6）	75.7	23.9
改良方法	0.9%氯化鈉溶液溶解	現(xiàn)配溶液	99.3（n=6）	0	99.3
		放置24h	99.3（n=6）	0	99.3
		放置48h	99.6（n=6）	0	99.6
		放置72h	99.1（n=6）	0	99.1

　　表2 不同溶劑溶解青霉素HPLC法測(cè)定色譜峰比較

溶劑名稱(chēng)	溶液狀態(tài)	色譜圖特征
		主峰數(shù)量（個(gè)）	降解物峰數(shù)量（個(gè)）	保留時(shí)間 （以主峰保留時(shí)間為1計(jì)）
水溶液	現(xiàn)配溶液	1	0	1
	放置24h	1	1	0.25；1
	放置48h	1	3	0.25；0.35；0.45；1
	放置72h	1	4	0.2；0.25；0.35；0.45；1
流動(dòng)相	現(xiàn)配溶液	1	1	0.25；1
	放置24h	1	3	0.2；0.25；0.35；1
	放置48h	0	3	0.2；0.25；0.35
	放置72h	0	3	0.2；0.25；0.35
乙醇	現(xiàn)配溶液	1	1	0.2；1
	放置24h	1	1	0.2；1
	放置48h	1	2	0.2；1；1.6
	放置72h	1	2	0.2；1；1.3
0.9%氯化鈉溶液	現(xiàn)配溶液	1	0	1
	放置24h	1	0	1
	放置48h	1	0	1
	放置72h	1	0	1

　　2.2 方法應(yīng)用 以市場(chǎng)抽檢的青霉素鉀樣品5批，青霉素鈉樣品1批，用0.9%氯化鈉溶液溶解樣品測(cè)定結(jié)果與CVP2005方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，考察其差異性，結(jié)果見(jiàn)表3。
　　表3 HPLC測(cè)定青霉素藥典法與改良法結(jié)果比較

序號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)	生產(chǎn)企業(yè)	批號(hào)	藥典法測(cè)定 結(jié)果（%）	改良法測(cè)定 結(jié)果（%）	差值
1	注射用青霉素鉀	重慶××公司	20070902	99.9	100.3	-0.4
2	注射用青霉素鈉	江蘇××公司	20080121	101.0	100.9	0.1
3	注射用青霉素鉀	江蘇××公司	070426	100.9	100.2	0.7
4	注射用青霉素鉀	北京××公司	070301	56.5	55.9	0.6
5	注射用青霉素鉀	咸陽(yáng)××公司	080107	0	0	0
6	注射用青霉素鉀	江蘇××公司	20080102N	91.0	91.4	-0.4

　　3.　分析小結(jié)
　　3.1 本試驗(yàn)采用CVP2005一部青霉素鈉“含量測(cè)定” 項(xiàng)下的方法，每ml中含2-苯乙酰胺和青霉素各0.2mg，兩峰之間的分離度為4.4(應(yīng)不小于2.0)，青霉素峰的理論塔板數(shù)為2738(應(yīng)不低于1600)，重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%(應(yīng)不大于2.0)。所以符合高效液相色譜法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求，測(cè)定結(jié)果可信、可靠、準(zhǔn)確。
　　3.2 試驗(yàn)結(jié)果表1表明，使用CVP2005方法以水溶解青霉素標(biāo)準(zhǔn)
　　品，現(xiàn)配溶液和放置24h、48h、72h的溶液測(cè)定值依次為100.0%、88.2%、43.3%、23.9%，主成分含量遞減，測(cè)定結(jié)果變化較大，穩(wěn)定性差;改用0.9%氯化鈉溶液溶解青霉素標(biāo)準(zhǔn)品，其溶液在72h小時(shí)內(nèi)測(cè)定結(jié)果幾乎無(wú)變化，穩(wěn)定性好，且測(cè)定結(jié)果與藥典方法現(xiàn)配溶液現(xiàn)測(cè)所得的結(jié)果基本一致，改良方法對(duì)時(shí)間的穩(wěn)定性表現(xiàn)突出。
　　3.3 不同溶劑溶解青霉素，采用相同的色譜條件，HPLC法測(cè)定青霉素色譜峰的特征表明(表2)，水溶解的青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液隨著放置時(shí)間的增加降解物數(shù)量增加，72h時(shí)出現(xiàn)4個(gè)降解物，降解物峰在主峰之前;流動(dòng)相溶解的青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液隨著放置時(shí)間增加降解物數(shù)量增加，48h時(shí)青霉素原形全部水解，出現(xiàn)3個(gè)降解物，降解物峰在主峰之前;乙醇溶解的青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液隨著放置時(shí)間的增加出現(xiàn)2個(gè)降解物，其中1個(gè)降解產(chǎn)物保留時(shí)間在主峰之后;水、流動(dòng)相、甲醇溶液溶解的青霉素溶液隨放置時(shí)間增加均有降解物產(chǎn)生，這一結(jié)果對(duì)動(dòng)物源性食品中青霉素降解物或代謝物殘留成分的分析可能有啟示和幫助。0.9%氯化鈉溶解的青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，72h內(nèi)未出現(xiàn)降解，重復(fù)性較好，對(duì)時(shí)間穩(wěn)定，優(yōu)于藥典的方法測(cè)定青霉素的含量。同時(shí)，對(duì)于青霉素在動(dòng)物體內(nèi)的原形的測(cè)定也可能有幫助。
　　3.4　表3表明CVP2005方法測(cè)得的結(jié)果與改良方法所得結(jié)果基本一致，藥典方法適合于樣品少，且現(xiàn)配現(xiàn)測(cè)，對(duì)測(cè)定結(jié)果不會(huì)有影響。對(duì)于樣品多的情況不適宜于此方法，改良方法更適用。
　　4. 結(jié)論
　　用0.9%氯化鈉溶液取代水溶液溶解青霉素，按照CVP2005一部方法測(cè)定青霉素的含量，穩(wěn)定性好，測(cè)定結(jié)果相同;對(duì)批量樣品自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定誤差小，檢驗(yàn)結(jié)果更可靠。該研究對(duì)獸藥典檢驗(yàn)方法的再修訂具有參考價(jià)值。
　　參考文獻(xiàn)
　　[1] 中國(guó)獸藥典委員會(huì)，《獸藥使用指南》二○○五年版，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，P14。
　　[2] 中國(guó)獸藥典委員會(huì)，《中華人民共和國(guó)獸藥典》二○○五年版，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，P107。
　　RP-HPLC improved methods of penicillin
　　LIU wei-hua,XIA shu-hong, CHEN juan, ZHAO juan,CHEN jian-rong,GAO xin
　　(Ningxia Institute of Veterinary Medicine Control,yinchuan,750001)
　　[Abstract] using 0.9% aqueous solution of sodium chloride solution replaced water solution to dissolve penicillin, determine the content of penicillin by the method according to chinese veterinary pharmacopoeia 2005, obtain the same determination results. This method has good reproducibility, stability on time , better than using the method in pharmacopoeia to determine the content of penicillin , low determinative error of lot samples with automatic injection,the determination results more reliable; it has reference value for the development and revision of the determinative method in veterinary pharmacopoeia.
　　[key words] high-performance liquid chromatography determination penicillin

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