芽孢桿菌菌體形態(tài)觀察生理生化試驗(yàn)

kiroco

將COL-J菌接種到初篩平板上37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)；接種于種子培養(yǎng)基中37℃，180r/m搖瓶培養(yǎng)12h，做革蘭氏染色觀察。
1 生理生化試驗(yàn)：以一株標(biāo)準(zhǔn)短小芽孢桿菌為對(duì)照，對(duì)COL-J菌的部分生理生化特征進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。
根據(jù)分離菌的菌落和菌體形態(tài)，芽孢的有無和著生情況，以及生理生化反應(yīng)，按東秀珠《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步分類[8] 。
2 16S rDNA的PCR擴(kuò)增
生物細(xì)胞DNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)中既具有保守的片段，又具有變化的堿基序列,保守的片段反映了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變片段則能表明物種間的差異．這些核苷酸序列則是不同分類級(jí)別生物(如科、屬、種)鑒定的分子基礎(chǔ)，以16SrDNA為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的靶分子進(jìn)行細(xì)菌快速分類鑒定，與其它細(xì)菌鑒定方法比較，具有高效、準(zhǔn)確、簡便、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[9]。
1.4.3.1細(xì)菌總DNA的提取
將菌種接種于20mL/150mL種子培養(yǎng)基，37℃ 180r/m培養(yǎng)12 h，按如下柱式DNA out抽提試劑盒使用手冊(cè)提取菌株COL-J的總DNA：
(1)取1mL菌液離心1 min后，重懸于0.6mL溶菌液中，吹打均勻，37℃保溫30 min。
(2)13000g離心10 min后棄上清夜。
(3)加入300uL溶液A到細(xì)菌沉淀中，吹打均勻。
(4)加入150uL溶液B到離心管中，顛倒數(shù)次混勻后溶液中將有白色絲狀懸浮物產(chǎn)生。
(5)65‍℃水浴放置3-5min。
(6)加入200uL氯仿，震蕩混勻30秒，溶液呈乳白色。
(7)13000g室溫離心2min，上清透明，中間層有白膜，小心轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，避免觸及中間的白膜。
(8)加入1.5倍體積（約0.6mL）的通用上柱夜到上清中，顛倒混勻全部轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫放置4min。
(9)13000g室溫離心1min，DNA吸附在離心吸附柱的膜上，倒棄收集管中的穿透液。
(10)將0.5mL通用洗柱液加入離心柱中，13000g室溫離心1min，棄穿透液。
(11)重復(fù)第10步操作一次。
(12)空甩半分鐘，將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
(13)加50-100uL自備TE（pH8.0），室溫放置3-5min。
(14)13000g室溫離心1min即得DNA溶液。
1.4.3.2 16S rDNA 的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定
上游引物序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
下游引物序列：5’-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反應(yīng)體系（25uL）為：10×buffer2.5uL, 25umol 的MgCl2 0.5uL，2.5mmol dNTP0.5uL，上游引物1uL,下游引物1uL, DNA0.5uL，5U/uL的Taq酶0.5uL，超純水17.5uL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃45sec，56℃30sec，72℃1.5min，循環(huán)30次；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送上海英駿 (invitrogen)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。
1.4.3.3 序列比對(duì)
將16S rDNA測(cè)序結(jié)果在GenBank的核酸數(shù)據(jù)中進(jìn)行同源性比對(duì)。